• Damien MARCHAL
• Université Paris 7 - Denis Diderot
• Unité Mixte de Recherche 7591
• LABORATOIRE D'ELECTROCHIMIE MOLECULAIRE
• Tel: +33 1 57 27 88 98
• email : marchal @ univ-paris-diderot . fr

Une équipe de chercheurs français a mis au point une nouvelle approche de PCR en temps réel qui, au lieu d'utiliser une détection par fluorescence, utilise une détection électrochimique in situ. Cette méthode a été inventée dans le Laboratoire d'Electrochimie Moléculaire de l'Université Paris Diderot. Elle résulte de la collaboration entre un chimiste, Dr. Benoit Limoges et un biologiste, Dr. Damien Marchal. La méthode a été récemment publiée dans le journal Analytical Chemistry de l'American Chemical Society (Real-Time Electrochemical PCR with a DNA Intercalating Redox Probe, T. Deféver, M. Druet, D. Evrard, D. Marchal, and B. Limoges, Anal. Chem., 2011, ASAP). Cette invention a fait l'objet d'un brevet français en Juin 2008 (FR 2008/03143), suivie d'une demande PCT en 2009 (WO 2009/147322).

Le principe est basé sur le suivi électrochimique durant la PCR d'une sonde redox intercalante de l'ADN qui, lors de son intercalation entre les bases de la double hélice de l’ADN, devient moins facilement détectable par une mesure électrochimique et ceux contrairement à son homologue libre en solution. Cette intercalation conduit ainsi à une décroissance exponentielle du signal électrochimique en fonction de la quantité d’ADN amplifiée. Ce principe est fonctionnel si la sonde redox intercalante satisfait à quatre critères: (i) elle doit fortement et spécifiquement se liée à l'ADN double brin; (ii) elle ne doit pas inhiber significativement le processus biologique d’amplification, (iii) elle doit être chimiquement stable durant les cycles de PCR, et (iv) elle doit être sensiblement détectée par voltammétrie à vagues carrées au cours des cycles de PCR. Un autre intérêt de la méthode est la possibilité de générer une courbe de fusion à la fin de la PCR. Ceci peut être obtenu simplement en chauffant le solution de PCR par une rampe linéaire de température et en mesurant le changement dans la réponse électrochimique résultant de la libération de la sonde redox intercalés dans l’ADN lors de la dissociation de l’ADN double brin en simple brin. La courbe de fusion offre ainsi la possibilité de différencier les amplifications spécifiques de celles non spécifiques (dimères d’amorces) et donne un accès à une analyse génotypique.

En termes de performances analytiques, la méthode se compare bien avec la PCR en temps réel optique. Elle présente les mêmes avantages que ceux basés sur l’utilisation de sonde fluorescente intercalante, à savoir: (i) une limite de détection de l’ordre de 100 copies dans 50 µL, une dynamique de réponse élevée (~ 8 à 10 logs), (ii) une détection en temps réel autorisant une analyse quantitative et évitant le laborieux travail, consommateur de temps, du traitement post-PCR, et (iii) la possibilité de discriminer des fragments d’ADN amplifiées de tailles différentes en réalisant une courbe de fusion.

En raison des coûts de développement et de fabrication faible comparés à l’optique (l’électrochimie repose sur l’utilisation de techniques éprouvées et simples issues du domaine de l’électronique), l‘approche proposée ici est très prometteuse pour le développement d’un appareil de PCR en temps réel nettement moins cher et plus robuste que ceux actuellement sur le marché. De plus, la relative insensibilité des méthodes électrochimiques à la réduction d'échelle ouvre des perspectives intéressantes pour une intégration du système de détection dans un instrument de «poche» comme une micropuce ou un dispositif microfluidique pour des applications de type «Point of care».

En 2009, un nouveau jalon a été atteint avec la création d'une spin-off (Easy Life Science, http://www.elice.fr/) et l'élaboration d'un instrument de PCR en temps réel électrochimique entièrement automatisée (LEO) et permettant de suivre en parallèle jusqu'à 48 amplifications.