Le poisson zébre (Danio Rerio) est un poisson d’eau douce qui vit dans les rivières de l’Inde, du Pakistan et autres pays d’Asie. Au cours des deux dernières décennies, le poisson zébre est devenu l’un des organismes modèles in vivo pour l'étude de divers processus tels que l'embryogenèse, la migration cellulaire, la formation des organes, le comportement et le sommeil. Récemment, le poisson zèbre a suscité l'intérêt dans d'autres branches de la recherche biomédicale en raison de son potentiel émergent pour la découverte de médicaments dans différents modèles de maladies. Cette revue présente une sélection des méthodes les plus couramment utilisées dans la recherche sur le poisson zèbre. Alors que l'élevage et la manipulation du poisson zèbre sont détaillés dans "Zebrafish Book" [The zebrafish Book http://zfin.org/zf_info/zfbook/cont.html], cet article présente les outils importants et les méthodologies disponibles dans la recherche sur le poisson zèbre comme la micro-injection, le morpholino knockdown et, la transplantation, discute leurs applications.

Le poisson zèbre est devenu un modèle de choix dans la recherche biomédicale portant sur un large éventail de sujets allant de la biologie du développement et de la morphogenèse aux neurosciences, la régénération et le vieillissement au cours des dernières décennies. La facilité d'entretien, le grand nombre de descendants, une option permettant la sélection génétique, et la clarté optique des embryons en développement constituent quelques facteurs qui rendent le poisson zèbre un modèle attrayant. Alors que le principal avantage du poisson zèbre est la possibilité de procéder à de l'imagerie in vivo haute résolution, la communauté a pris du retard dans le développement d’animaux transgéniques et pour le « knock-out » efficace de gènes par rapport à d’autres modèles comme la drosophile (Drosophila melanogaster) et la souris en raison d'un manque d'outils génétiques appropriés. Cependant, au cours des dernières années, ces écarts se sont réduits en raison de la progression rapide de la technologie. De nouveaux outils tels que les nucléases à doigts de zinc qui permettent un « knock-out » efficace de gènes ou les technologies MAZe et brainbow pour la création d’animaux transgéniques, permettent d'évaluer la complexité des processus de développement et d’acquérir une meilleure compréhension des mécanismes des maladies chez un vertébré.

De plus, les génomes de l'homme et du poisson zèbre partagent environ 70 % d'homologie, suggérant la conservation d’un grand nombre de gènes et de voies génétiques. En raison de la disponibilité des plates-formes technologiques, le poisson zèbre a été utilisé dans la sélection de médicaments à débit moyen dans le contexte de l'organisme complet (par rapport aux systèmes acellulaires ou de cellule unique). Cette revue se concentre sur les méthodes pertinentes, à commencer par les méthodes d’injection, d’immunohistologie et le marquage in situ, puis discute le « knock down » de l’expression des gènes, la mutagénèse ciblée, les outils transgéniques, et les expériences de mosaïque.

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Figure 1. Injection dans les embryons de poisson zèbre dans les premières étapes de développement. Les schémas sur la gauche représentent le principe de la conception de construction pour la synthèse d’ARNm. Les schémas du milieu présentent la procédure d’injection et les images sur la droite présentent les embryons de 1 jour après l’injection. A, L’ARNm codant pour EGFP suivie par le 3’ UTR de la globine est injecté dans le sac vitellin d’un embryon de poisson zèbre au stade une cellule L’image est adaptée de la Figure 1 dans réf. [10]. B, L’ARNm codant pour EGFP suivie par le 3’UTR de la globine est injecté dans une cellule d’un embryon de poisson zèbre au stade 8 cellules. L‘image est adaptée, avec permission, de la Figure 2 dans la réf. [25] (DOI: 10.1242/dev.01951) C, L’ARNm codant pour EGFP suivi du 3’ UTR de nanos1 injecte dans le sac vitellin d’un embryon de poisson zèbre au stade une cellule. L’image provient de la collection personnelle de l’auteur.

L'injection est la technique la plus fréquemment utilisée lorsque l'on travaille avec le poisson zèbre. Pendant l'injection, une certaine substance comme l'acide nucléique, une protéine ou une drogue est introduite dans l'embryon, le plus souvent dans les premiers stades de développement (Figure 1). Les injections sont effectuées avec des aiguilles de verre remplies avec le matériel à délivrer. Des micromanipulateurs contrôlent normalement les aiguilles et peuvent changer la position d'une aiguille par rapport à l'embryon avec facilité. La pression d'air fournie par un dispositif externe est utilisée pour libérer le contenu de l’aiguille dans l'embryon. L'injection permet une livraison rapide du matériel dans les embryons. Un chercheur expérimenté peut injecter quelques centaines d'embryons en une heure. Un protocole d'injection détaillée est disponible dans la référence [1] et ses films peuvent être consultés sur [Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function http://www.jove.com/details.php?id=1115].

Les injections sont le plus souvent utilisées pour la surexpression transitoire de protéines dans les embryons. La surexpression transitoire pendant le développement précoce du poisson zèbre (jusqu'à 3 jours) est réalisée par l'introduction de l'ARNm codant pour la protéine d'intérêt dans les embryons au cours des deux premières heures de développement. Pour stabiliser la transcription de l'ARNm injecté, les régions d'ARNm régulatrices, telles que les régions non traduites (UTR) en 3’ sont utilisées (Figure 1). Il s'agit notamment des séquences poly A tels que celles présentes dans la beta- globine de Xenopus laevis, qui stabilisent la transcription de l'ARNm dans chaque cellule de l'embryon contenant cet ARNm (figure 1A et B). Pour certains types de cellules, comme les cellules germinales primordiales, des régions UTRs spécifiques telles que celles trouvées dans le 3’ -UTR du gène Nanos1 peuvent être utilisées pour stabiliser l'ARNm et pour promouvoir la traduction efficace des protéines, spécifiquement dans ces cellules tout en le dégradant dans les cellules somatiques [2] (figure 1C). Un autre exemple montrant le rôle des régions 3’ -UTR dans la localisation de l'ARNm est l'ARNm de strabisme, qui est confiné dans les blastomères dorsaux dès le stade de quatre cellules [3].

Pour diriger l'expression de la protéine dans chaque cellule de l'embryon en développement, l'ARNm correspondant à une protéine spécifique est injecté dans le sac vitellin de l'embryon au stade une cellule (figure 1A). Pour générer des embryons mosaïques, dans lesquels la protéine est exprimée dans une sous-population de cellules, l'ARNm est injecté dans un seul blastomère de l'embryon au stade 8 cellules ou dans les étapes ultérieures (figure 1B). Une autre stratégie utilisée pour obtenir l'expression mosaïque d’une protéine est d’injecter les plasmides d'ADN dans un seul blastomère de l'embryon au stade une cellule ou plus tard (directement dans une cellule spécifique), mais cette approche est moins efficace et prend plus de temps pour la synthèse des protéines par rapport à l'injection de l'ARNm.

Bien que l'expression transitoire de protéines par injection d'ARNm soit un moyen rapide et facile d'étudier la localisation des protéines et la fonction chez le poisson zèbre dans les premiers stades de développement, cette approche ne convient pas lorsque l’on s’intéresse aux derniers stades de développement ou lorsqu'une protéine doit être exprimée dans un tissu particulier ou un type de cellule.

La technique d'hybridation in situ est une des plus anciennes méthodes utilisées dans la recherche sur le poisson zèbre. Elle permet l’analyse de profils d'expression des gènes dans les embryons intacts ou sectionnés [4]. Au cours de la procédure dans l'hybridation in situ, une sonde d'ARNm antisens est conçue pour reconnaître et lier le transcrit endogène, qui est ensuite détecté par une technique basée sur la couleur ou la fluorescence. L'approche classique utilise une procédure de marquage basée sur la couleur et le signal est visualisé à l'aide d'un microscope optique (figure 2A). Récemment, les techniques de détection fluorescente ont été optimisées pour l'utilisation chez le poisson zèbre, permettant la détection simultanée de trois sondes avec l'approche normale, ou jusqu'à cinq sondes en utilisant l'amplification HCR (figure 2B et C) [5] [6]. L’hybridation in situ basée sur la fluorescence est la méthode de détection du signal préférée en raison de sa sensibilité accrue et de la détection simultanée de plusieurs sondes, tandis que la détection basée sur la couleur se limite à deux sondes. Cependant, la détection basée sur la couleur classique ne nécessite pas de microscope confocal et peut être utilisée lorsque le microscope confocal n'est pas disponible.

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Figure 2. Expression de gènes et visualisation de protéines. A, Pattern d’expression du gène sox1a dans un embryon de 24h détecté par la méthode d’hybridation in situ basée sur la couleur (de [ZFIN ID: ZDB-IMAGE-070503-669 http://zfin.org/cgi-bin/webdriver?MIval=aa-imageview.apg&image_table=image&OID=ZDB-IMAGE-070503-669]).B, Patterns d’expression de dlx2a, dbx1a et shha dans le cerveau détectés par la technique d’hybridation in situ basée sur la fluorescence 3 couleurs. Une vue dorsale d’un embryon de 24 h avec la partie antérieure sur la gauche, (adaptée de la figure 7F dans [6] ). C. Patterns d’expression de ntla (jaune), sox10 (magenta), elav13 (vert), tpm3 (bleu) et flk1-EGFP (rouge) révélés par la technique d’amplification HCR. Les images représentent deux Z sections différentes de l’aire postérieure d’un embryon de 27h obtenues par microscopie confocale, adapte avec la permission de Macmillan Publishers Ltd: Nature Biotechnology: 28, 1208-12, copyright (2010). D. Patterns d’expression de la glutamine synthétase en rouge et Pax6 en vert détectés par immunofluorescence. Le marquage DAPI est en bleu. Une section confocale de la rétine d’un embryon de stade précoce (avant éclosion) est présentée. L’image est adaptée de la Figure 3A dans [7].

L’immunomarquage est un procédé efficace pour détecter la présence et la localisation d'une protéine endogène. Le principal obstacle à l'exécution d'un immunomarquage réussi est l’exposition de l'antigène (« antigen retrieval »). Une autre difficulté provient d'une quantité relativement faible d'anticorps de haute qualité disponibles dans le commerce développés pour l'utilisation chez le poisson zèbre. Une étude récente a proposé une méthode améliorée pour le traitement des embryons pour l’exposition d'antigène efficace (figure 2D) [7].

Un certain nombre d'outils pour la transgénèse ont été adaptés à partir d'autres organismes et optimisés pour l'utilisation chez le poisson zèbre permettant l'expression stable de protéines et le ciblage conditionnel de protéines pour l'expression dans les tissus définis.

Le système le plus populaire pour la production d'animaux transgéniques chez le poisson zèbre est le système transposon Tol2, provenant du poisson medaka [8] [9]. Le produit de construction pour l'introduction de l'ADN dans le génome du poisson zèbre se compose généralement de deux séquences régulatrices cis minimale de l'élément Tol2 positionnées aux extrémités 5’ et 3’ d'un promoteur minimal suivi par une protéine fluorescente (figure 3). Le vecteur contenant Tol2 est apte à recevoir des inserts d'ADN allant jusqu’à 11 kb [8]. Une telle construction d'ADN est injectée conjointement avec l'ARNm codant pour un gène transposase directement dans la cellule de l'embryon au stade une cellule (figure 3). Ces embryons sont élevés et les poissons adultes sont examinés pour identifier les fondateurs, dans lequel les insertions ont été créées dans la lignée germinale qui peut être transmise à la génération suivante (représentée comme F1 dans la figure 3).

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Figure 3. Transgénèse utilisant le système Tol2. Lors de la première étape, le plasmide est créé, dans lequel la protéine désirée est clonée en aval du promoteur spécifique (par exemple, le promoteur d'un gène spécifique de l'œil) et les deux éléments TOL 2 minimaux sont positionnés aux extrémités 3’ et 5’ flanquantes. Ensuite, le vecteur plasmidique et l'ARNm codant pour la transposase Tol2 sont injectés dans la cellule de l'œuf fécondé. Le poisson fondateur possèdera les cellules germinales, dans lesquelles la construction aura été intégrée dans le génome. La descendance issue de ces cellules germinales transgéniques dans la F1 aura l'expression tissue spécifique de la protéine, l'EGFP, dans l'œil, dans cet exemple.

Une autre stratégie pour l'expression de protéines régulée qui a récemment été adaptée pour l'utilisation dans le poisson zèbre, est la recombinaison médiée par les sites Cre spécifiques [ref ref 10]. La recombinaison médiée par Cre permet l'induction de l'expression de la protéine d'une manière contrôlée temporellement (figure 4A). L'expression de la Cre-recombinase peut encore être régulée par le promoteur « Heat shock » permettant une haute précision spatiale et temporelle de l’expression de la protéine d’intérêt. Cette stratégie a été utilisée dans le système transgénique MAZe pour une expression de protéines spatio-temporelle dans les embryons mosaïques [11] (figure 4B). Le système MAZe combine l'utilisation de la Cre recombinase exprimée sous le promoteur « Heat shock » et le système GAL4/UAS adapté pour l'utilisation chez le poisson zèbre. Suite à l'induction de choc thermique, la Cre-recombinase est exprimée, induisant l'excision de la cassette fermée par les éléments lox P, ce qui permet la synthèse de la protéine Gal4VP16 qui à son tour se lie au promoteur UAS dirigeant l'expression de la protéine spécifique. Cette méthode est particulièrement utile lors de l'induction de l'expression de dominants négatifs dans une population choisie de cellules, à un temps défini.

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Figure 4. Adaptations des techniques de transgénèse. A, Recombinaison induite par Cre. Un schéma de la construction transgénique. En l'absence de Cre, la protéine mCherry est exprimée de manière ubiquitaire, commandée par le promoteur EF1. L’addition de Cre induit la recombinaison et la perte du fragment mCherry, résultant en l'expression de l'EGFP. Adapté de la Figure 1 dans [10]. B, système transgénique MAZe pour l'induction de l'expression de la protéine d'une manière spatio-temporelle. Un schéma des constructions transgéniques utilisées pour induire l'expression spatio-temporelle des protéines dans l'embryon. La principale construction transgénique contenant le gène Gal4VP16 Gal4VP16 sous le contrôle du promoteur EF1 est exprimée de manière ubiquitaire. Le gène codant pour une recombinase Cre sous le contrôle d'un promoteur de choc thermique (Hsp70) est cloné dans une orientation inverse entre le promoteur EF1 et le gène Gal4VP16 empêchant l'expression de la protéine Gal4VP16 en l'absence d'un choc thermique. En réponse à un choc thermique, l'expression de Cre est induite dans une sous-population de cellules. Ces cellules sont détectées par l'expression de la protéine fluorescente rouge (RFP), sous le contrôle du promoteur UAS activé par la protéine Gal4VP16 La présence d'une construction transgénique supplémentaire exprimée dans le tissu spécifique et contenant le promoteur UAS permet l'expression tissu-spécifique des protéines supplémentaires, par exemple, une forme mutée d'une protéine.

Morpholinos. L'approche standard pour bloquer spécifiquement la fonction d'un gène dans un embryon de poisson zèbre dans les premiers stades de développement utilise des oligonucléotides antisens modifiés appelés morpholinos [12] [13]. Les morpholinos sont des molécules synthétiques, d’environ 25 nucléotides, et sont disponibles à Gene Tools [ref Gene Tools LLC http://www.gene-tools.com/].Deux types de morpholinos sont couramment utilisés pour interférer avec l'expression des protéines: les morpholinos ATG et les morpholinos d’épissage. Les morpholinos ATG agissent en bloquant l'initiation de la traduction des protéines dans les ribosomes, rendant ainsi les embryons dépourvus d'une protéine particulière [14]. La figure 5A montre un exemple d'un embryon de trois jours manquant ses nageoires pectorales à la suite d'un traitement avec le morpholino contre le gène fgf24 [15]. Les morpholinos d’épissage se lient et interférent avec la procédure d'épissage de l'ARN, résultant en une protéine tronquée. Par conséquent, les morpholinos d’épissage pourraient être aussi utilisés pour étudier la fonction d'un domaine protéique particulier.

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Figure 5. Interférer avec la fonction du gène. A, Action des morpholinos ATG. Vue de dessus de la partie antérieure d’un embryon de poisson zèbre de 3 jours traité avec le morpholino contrôle (panneau supérieur) et le morpholino contre fgf24 (panneau inférieur). Les images sont adaptées, avec permission, de la figure 5A dans [15] (DOI: 10.1242/dev.007823). B, Action de la Zinc Finger nucléase (ZFN). Le schéma illustre le principe du mécanisme d’action de nucléase à doigt de zinc. Chaque monomère d'un ZFP reconnaît une séquence d'ADN spécifique (marqué en bleu et rouge), tandis que le domaine nucléase (FokI, identifié en orange) clive l'ADN. Les images en dessous montrent l'embryon de contrôle (l'image du haut) et l'embryon mutant dans lequel ont été utilisés le ZFN contre le gène no tail (l'image du bas). Les images sont adaptées avec la permission de Macmillan Publishers Ltd: Nature Biotechnology: 26, 695-701, droit d'auteur (2008).

Des morpholinos protecteurs de cibles ont été récemment développés pour interférer avec le fonctionnement des micro ARNs endogènes (miARN) en protégeant spécifiquement leurs cibles. Ces morpholinos sont complémentaires aux séquences de liaison des miARNs présentes dans les ARNm cibles et agissent en empêchant la liaison du miRNA à sa cible, stabilisant ainsi la transcription de l'ARNm [16]. De même, des morpholinos peuvent être utilisés pour inhiber la fonction des miARNs directement [17]. Les considérations générales dans le traitement des morpholinos et l'interprétation des résultats expérimentaux sont décrits en détail dans [14] [18].

Les morpholinos représentent une stratégie très efficace pour interférer avec un gène ou la fonction de miARN avec une grande précision, mais il y a plusieurs problèmes concernant morpholinos qui doivent être pris en considération.

1. Les morpholinos sont normalement injectés dans le sac vitellin et pourraient donc également affecter toutes les cellules de l'embryon en développement et, ainsi, compromettre le bon développement dans les cas où la fonction de la protéine perturbée est nécessaire ubiquitairement. Ce problème peut cependant être évité par l'injection du morpholino dans un seul blastomère (figure 1B) dans le but de cibler plus précisément les cellules d'intérêt.
2. L'effet de morpholinos ne dure que les quelques premiers jours de développement (jusqu'à 5 jours [14]), les rendant impropres à l’étude de la fonction d'un gène à des stades ultérieurs de développement.
3. Les morpholinos ne sont pas efficaces lorsque la protéine maternelle apparentée est présente.
4. Bien que les morpholinos éliminent la fonction des protéines, l'ARNm correspondant reste présent dans l'embryon. Dans les cas où l'ARNm joue un autre rôle en plus de servir de modèle pour la traduction des protéines, il pourrait potentiellement conduire à des effets non spécifiques, surtout si les taux d'ARNm sont importants.

Nucléases à doigts de zinc. Alors que, jusqu'à récemment, il n'existait pas de méthode fiable pour induire la mutagénèse ciblée chez le poisson zèbre, deux articles publiés en 2008 ont adapté l'utilisation des nucléases à doigts de zinc (ZFN) pour créer les cassures double brin ciblées dans le génome du poisson zèbre. Dans deux études indépendantes, les auteurs ont démontré l'utilisation des ZFNs pour générer des cassures, qui sont ensuite réparées par liaison d’extrémités non-homologues, résultant dans de petites insertions et des suppressions. ZFN représente une protéine de fusion chimérique comprenant une protéine à doigt de zinc (ZFP) et le domaine de clivage de l'endonucléase FokI [19]. La spécificité de liaison à l'ADN est définie par la ZFP, qui peut être conçue pour reconnaître une variété de séquences d'ADN cibles [19] (Figure 5B et [20], [21]). La partie importante dans la conception ZFN est l'optimisation de la protéine ZFP pour la reconnaissance de la cible. Des protocoles détaillés et des informations complémentaires sont disponibles sur le site ZFIN [Zinc Finger Consortium http://zincfingers.org/default2.htm] et des conseils sur la façon d’utiliser la plate-forme OPEN pour l'ingénierie d'un array de protéine ZFP sont donnés dans [22]. Des informations supplémentaires sur la façon de localiser des sites cibles ZFN peuvent être obtenues dans [23].

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Figure 6. Technique de transplantation. A, La procédure de transplantation. Le schéma illustre le processus de transplantation au cours duquel les cellules sont retirées de l'embryon donneur et ensuite introduites dans l'embryon accepteur au cours de l'étape gastrulation. B, les cellules GFP-marquées greffées de l'embryon transgénique portant la construction GFAP: GFP sont présentées dans le cerveau antérieur de l'embryon donneur. La coloration rouge correspond à l'alpha-tubuline. L'image est reproduite à partir de la figure 2 dans [24].

La transplantation est l'une des techniques les plus anciennes utilisées en biologie du développement. Au cours de la transplantation, un groupe de cellules est supprimée d’un embryon, appelé l'embryon donneur, et introduit dans un autre embryon, qui est appelé l'embryon accepteur (figure 6A). La technique de transplantation est essentielle pour répondre à certaines questions importantes en biologie du développement, comme savoir si une fonction génique est autonome ou non. Dans les expériences qui étudient la fonction des gènes, les cellules mutantes sont transplantées dans un embryon de type sauvage et, inversement, les cellules de type sauvage sont transplantées dans un embryon mutant et les phénotypes des cellules transplantées et ceux des embryons hôtes sont comparés. La transplantation peut également être utilisée lorsque l'injection de morpholinos est mortelle. Dans ce cas, un groupe de cellules de l'embryon injecté avec un morpholino est transplanté dans un embryon de type sauvage dans les premiers stades du développement embryonnaire, permettant ainsi d’étudier l'effet de l'inactivation de la protéine sur les cellules dans un environnement de type sauvage. Les transplantations sont également utilisées pour étudier l'effet d'un facteur diffusible, par exemple un facteur de croissance ou une chimiokine sur des cellules voisines. Un exemple de la façon dont les transplantations sont utilisées pour étudier les mécanismes qui sous-tendent les interactions neurone-glie est présentée dans [Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation http://www.jove.com/details.php?id=1422] [24] (figure 6B).