L’extraction d’ADN est requise pour des applications de biologie moléculaire telles que la PCR, la digestion par les enzymes de restriction, le Southern blotting etc., et pour l’analyse d’échantillons médico-légaux et cliniques de même que les échantillons de terre et environnementaux. Il existe beaucoup de kits d’extraction et de purification de l’ADN dans le commerce. Cependant il a été montré que la sensibilité de détection par PCR de l’ADN extrait varie selon le kit utilisé [1]. Choisir le kit adéquat peut permettre de gagner du temps sur l’optimisation du kit et l’exécution de l’expérience.

Les facteurs à prendre en considération dans le choix du kit sont:

1. L’origine de l’échantillon: Des kits différents sont utilisés pour des échantillons de sources différentes car ils doivent être traités différemment. Par exemple, un échantillon de sang sera traité différemment d’une tache de sang séché. Les sources des échantillons devant être considérées lors de la sélection du kit d’extraction incluent les sources humaine, le sang, les cheveux, les rongeurs,les feuilles, les bactéries,les levures, les champignons, les insectes, les matières fécales, les fluides corporels, les spores,la terre, les échantillons cliniques, (ex. biopsies, ponctions à l'aiguille fine), les échantillons médico-légaux (ex. taches de sang séché, , frottis buccal), et les empreintes digitales.
2. La méthode de préparation de l’échantillon: Le kit doit être compatible avec la méthode de préparation de l’échantillon. Les différentes méthodes de préparation des échantillons peuvent être: fraiche ou à partir de culots cellulaires préalablement congelés, de sections de tissus fixés dans la formaline ou inclus en paraffine, de sections de tissus congelés, de cellules fixées dans l’éthanol et des échantillons préservés dans Oragene™.
3. Usage prévu: La qualité et la pureté de l’ADN obtenues avec le kit d’extraction doivent être adéquates pour l’application prévue en aval qui peut être du séquençage, du fingerprinting, de la PCR, de la qPCR, du southern blotting, de RAPD, de l’AFLP, et du RFLP, des digestions avec des enzymes de restriction, la préparation de librairies shotgun.
4. Contenu humique: Si l’échantillon présente un contenu humique tel que du compost, des sédiments ou du purin, un kit qui permet l’élimination du contenu humique doit être utilisé car ces substances peuvent inhiber les applications en aval comme la PCR.
5. La quantité d’échantillon: Différent kits sont adéquats pour traiter des échantillons de différente taille. Le kit utilisé va dépendre du nombre de cellules mammaliennes cultivées (10⁵-10⁷) et de cellules bactériennes (10⁶-10¹¹), mg de tissu, quantité de sang (100 µl to 1 ml), mg de terre (250 mg -10 g), mg de tissu végétal etc.
6. Rendement obtenu.
7. La possibilité d’automatiser la procédure d’extraction.
8. Simplicité: La simplicité du protocole doit être considérée en fonction de l’expérience du personnel qui réalise l’extraction d’ADN.

Excepté les facteurs décrits ci-dessus, les critères de bases que doit suivre une méthode d’isolation d’ADN incluent :

1. L’efficacité de l’extraction.
2. La quantité d’ADN obtenue doit être suffisante pour les applications en aval.
3. L’élimination des contaminants.
4. La qualité et la pureté de l’ADN. L’absorbance en ultraviolet peut être utilisée pour déterminer la pureté de l’ADN extrait. Pour un échantillon d’ADN pur, le the ratio de l’absorbance à 260 nm et de l’absorbance à 280 nm (A260/A280) est de 1.8. Un ratio inférieur à 1.8 indique que l’échantillon est contaminé avec des protéines ou un solvant organique comme le phénol.

Les différentes étapes impliquées dans l’extraction d’ADN sont les suivantes:

1. Lyse cellulaire. la première étape implique la lyse cellulaire pour accéder à l’ADN. Celle-ci peut être accomplie par des méthodes physiques ou chimiques.
2. L’élimination des lipides. L’élimination ou la séparation des lipides membranaires et des débris cellulaires se fait généralement à l’aide de détergents comme le sodium dodecyl sulfate et par centrifugation.
3. L’élimination des protéines de l’extrait cellulaire. La dénaturation des protéines est effectuée à l’aide d’une protéase telles que la pronase ou la protéinase K. Aprés quoi, les protéines dénaturées sont séparées de l’extrait cellulaire.
4. L’élimination de l’ARN. L’élimination de l’ARN est effectuée par addition de RNase qui dégrade rapidement l’ARN en ribonucléotides. Cette étape est généralement optionnelle dans chaque kit.
5. La précipitation/agrégation/élution de l’ADN.

Les méthodes d’extraction de l’ADN communément utilisées dans les kits d’extraction ou de purification de l’ADN sont:

1. L’extraction organique. Cette méthode a été très largement utilisée et est une méthode d’extraction de l’ADN conventionnelle. Dans la première étape, les cellules sont lysées et les débris cellulaires éliminés par centrifugation. Dans un deuxième temps, les protéines sont dénaturées à l’aide d’une protéase. Dans la méthode d’extraction organique, après dénaturation, les protéines sont éliminées à l’aide de solvants organiques tels que le phénol, ou un mélange 1:1 de phénol et de chloroforme. Les solvants organiques précipitant les protéines laissant les poly nucléotides (ADN et ARN) en solution, le précipité de protéines est ensuite séparé par centrifugation. Dans la dernière étape, l’ADN purifié est généralement récupéré par précipitation à l’aide d’éthanol ou d’isopropanol. En présence de cations monovalent tel que Na+, et à une température inférieure à 20°C, l’éthanol absolu précipite l’ADN efficacement. Une autre propriété de l’éthanol est qu’il ne précipite que les acides nucléiques polymères et laisse en solution les acides nucléiques monomères et de petite taille comme les ribonucléotides provenant du traitement à la RNase. L’ADN précipité est généralement resuspendu dans un tampon TE ou de l’eau distillée. Les limites de cette méthode sont: l’utilisation de solvants organiques dangereux et le temps nécessaire pour accomplir l’extraction. De plus, des résidus de phénol ou de chloroforme peuvent être présents dans l’ADN extrait et peuvent inhiber certaines applications en aval telles que la PCR. Un exemple de kit basé sur une modification de cette méthode est le kit Easy-DNA™ (Invitrogen).
2. Technologie utilisant la silice. C’est une méthode largement utilisée dans les kits courants. L’ADN est absorbé spécifiquement sur la membrane/billes/particules de silice en présence de certains sels et à un pH particulier. Les contaminants cellulaires sont éliminés par les différentes étapes de lavage. L’ADN est finalement élué dans un tampon faible en sel ou tampon d’élution. Des sels chaotropes sont inclus pour aider à la dénaturation de protéines et l’extraction d’ADN. L’avantage de cette technologie est qu’elle peut être incorporée dans des colonnes de centrifugation ou des micro-puces, elle est rentable, présente une procédure plus simple et plus rapide que l’extraction organique et est adaptée pour l’automatisation. Les kits basés sur cette méthode comprennent Purelink Genomic DNA extraction kit (Invitrogen), DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen) etc.
3. Séparation magnétique. Cette méthode est basée sur la liaison réversible de l’ADN à une surface solide/billes/ particules magnétiques qui ont été recouvertes d’un anticorps liant l’ADN ou d’un groupe fonctionnel qui interagit spécifiquement avec l’ADN. Après liaison de l’ADN, les billes sont séparées des autres composants cellulaires contaminants, lavées et finalement l’ADN purifié est élué par extraction à l’éthanol. L’avantage principal de cette méthode est qu’elle est rapide et adaptable à l’automatisation. Cependant, elle peut être plus coûteuse par rapport aux autres méthodologies présentées dans cette revue. Des exemples de kits basés sur cette méthode sont Agencourt DNAdvance Kit (Beckman Coulter), Magnetic Beads Genomic DNA Extraction Kit (Geneaid) etc.
4. Méthode d’échange d’anion. Cette méthode est basée sur l’interaction spécifique entre des phosphates négativement chargés de l’acide nucléique et les molécules de surface positivement chargées du substrat. L’ADN se lie spécifiquement au substrat en présence de faible concentration de sels, les contaminants sont éliminés par les étapes de lavage utilisant un tampon à concentration faible ou moyenne en sels, et l’ADN purifié est élué à l’aide d’un tampon à concentration élevée en sels. Cette technologie est plus couramment utilisée dans les kits d’isolation des plasmides tels que PureLink® HiPure Plasmid DNA Purification Kits (Invitrogen), Qiagen plasmid mini/midi kits (Qiagen), and NucleoBond® PC kits (Macherey Nagel).

D’autres méthodes sont aussi utilisées telles que la purification par « salting out », les gradients de densité au chlorure de césium, et la résine chelex 100. Les méthodes d’isolation de l’ADN sont souvent modifiées et optimisées pour différents types cellulaires. Le cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) et le thiocyanate de guanidium (GITC) sont souvent inclus dans les protocoles d’extraction d’ADN de tissue végétal et sont discutés plus en détails dans “ Kits pour l’extraction d’ADN de tissus et cellules végétales ".

Chaque kit disponible dans le commerce présente certaines caractéristiques et avantages. Une liste des kits communément utilisés pour l’extraction et la purification de l’ADN a été compilée indiquant la technologie utilisée, les applications, le rendement et les avantages associés à chaque kit. Les kits d’extraction d’ADN mammalien, microbien et de matériel végétal sont revus ci-dessous. (Table 1)

Les cellules bactériennes sont les plus couramment étudiées et utilisées parmi les microorganismes. Tout d’abord, une courbe de croissance est obtenue pour un type cellulaire donné en mesurant la densité optique (OD) à 600 nm, à différents temps durant la culture. Pour l’extraction d’ADN, les cellules bactériennes sont cultivées en milieu liquide jusqu’à ce qu’elles atteignent une densité maximum de 2-3x10⁹ cellules/ml, elles sont ensuite récoltées. La croissance des cellules peut être surveillée par l’analyse de la turbidité de la culture, et quantifiée en mesurant la densité optique à 600 nm et en la correlant à la courbe de croissance établie précédemment. Les cellules collectées peuvent être ensuite traitées pour l’extraction de l’ADN en utilisant différents kits. La lyse cellulaire pour l’extraction d’ADN bactérien est souvent effectuée par des méthodes chimiques utilisant le lysozyme, l’EDTA, le lysozyme et l’EDTA, des détergents etc. Comme décrit dans l’introduction, la lyse cellulaire est suivie par l’élimination des composants cellulaires de l’ADN à l’aide d’une méthode d’extraction organique, ou d’une technologie utilisant la silice etc. La dernière étape implique la précipitation de l’ADN pour obtenir une solution d’ADN pur de concentration élevée. Une procédure similaire est suivie pour les levures et autres microbes.

Beaucoup de kits sont disponibles pour l’extraction d’ADN à partir de microbes comme les bactéries, levures, et champignons. Bien que le principe derrières les différentes étapes soit le même, les kits présentent beaucoup de modifications dans le tampon de lyse, la méthode de séparation de l’ADN, la membrane utilisée, le tampon de lavage et d’élution de ADN. Le but de ces modifications est d’améliorer l’efficacité de l’extraction d’ADN du kit. Les kits d’extraction d’ADN à partir de cellules microbiennes disponibles dans le commerce sont brièvement décrits ci-dessous. Ces kits sont également présentés dans la Table 1.

1. Bacterial Genomic DNA Mini-prep Kit (BayGene/Sigma-Aldrich): Ce kit peut être utilisé pour isoler de l’ADN de haute qualité, à partir de bactéries Gram négatives et positives, qui est utilisable pour des digestions par les endonucléases de restriction, la PCR et le Southern blot. Il emploie un système basé sur la silice avec un format de micro colonnes de centrifugation et peut isoler de l’ADN de taille allant jusqu’à 50 kb en longueur. Brièvement, les cellules sont lysées enzymatiquement dans une solution de sels chaotropes, l’ADN est absorbé spécifiquement sur une membrane de silice, les autres composants du lysat sont éliminés par lavage. Finalement l’ADN est élué dans un tube de collection dans un tampon adapté.
2. BACMAX DNA purification kit (Epicentre Biotechnologies/ Cambio): Ideal pour l’isolation d’ADN de clones BAC simple copie ou de clones induit CopyControl™, pour des applications comme le séquençage, fingerprinting, PCR, la préparation de librairies shotgun. Il est basé sur une méthode modifiée de lyse alcaline et utilise l’EPICENTREs® RiboShredder™ RNase Blend avec différentes étapes de précipitation sélective pour éliminer les contaminants.
3. PowerSoil DNA isolation kit (MO BIO Laboratories Inc): Ce kit peut être utilisé pour isoler de l’ADN microbien provenant de tous types de terre et d’échantillons environnementaux, de même que d’échantillons de matières fécales, de selles et de biosolides. Il fournit une méthode brevetée d’élimination de substances humiques qui élimine les inhibiteurs de PCR, de tous types d’échantillons de terre même les plus difficiles et produit un ADN de haute qualité qui peut être utilisé pour les applications en aval telles que la PCR, la qPCR et le « next generation sequencing ».
4. PowerMax Soil DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories Inc): Ce kit permet l’isolation d’ADN à partir de large quantité de n’importe quelle terre ou d’échantillons environnementaux présentant une charge microbienne faible ou élevée qui inclue les bactéries Gram-positives et Gram-négatives, les champignons, les algues, et les actinomycètes, et avec un contenu humique incluant le compost, les sédiments ou du purin. Il est basé sur le kit d’isolation d’ADN PowerSoil® et utilise aussi un nouvel inhibiteur breveté Removal Technology® pour éliminer les composés inhibiteurs de PCR présents dans la substance humique. La couleur brune est souvent associée avec l’ADN isolé d’échantillons de terre.
5. UltraClean Microbial DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories Inc): Ce kit permet l’isolation d’ADN génomique de haute qualité de taille allant jusqu’à 50 kb, à partir de 1.8 ml de culture microbienne de différents types de microorganismes comme les levures, les champignons, les bactéries Gram-négatives et Gram-positives, et spores bactériennes et fongiques. Le principe de ce kit est de lyser les microorganismes en utilisant une combinaison de détergents, chaleur et de forces mécaniques contre des billes spécialisées. L’ADN libéré est ensuite lié à un filtre de silice, lavé et élué dans du tampon Tris certifié sans ADN.

Les étapes de base impliquées dans l’extraction d’ADN à partir de cellules animales ou tissus sont identiques à celles discutées dans l’introduction et dans le chapitre sur les microbes. Cependant, les kits incluent des modifications à la méthode de base prenant en compte les caractéristiques particulières des cellules animales. La culture et la préparation de cellules animales sont très différentes de celles de cellules microbiennes. La plupart des cellules animales ne présente pas de paroi cellulaire comme les cellules microbiennes et sont donc plus facilement lysées à l’aide de détergents uniquement. Les cellules animales doivent, cependant, être homogénéisées mécaniquement ou traitées par des enzymes avant la lyse. La lyse cellulaire est suivie par la séparation de l’ADN des autres composants cellulaires et sa purification. Beaucoup de kits n’utilisent pas la méthode conventionnelle d’extraction organique au phénol/chloroforme et de précipitation à l’éthanol. Ceci minimise les dommages induits par les solvants sur l’ADN. Par exemple AccuPrep Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer) et GFX Genomic Blood DNA Purification Kit (GE Healthcare) utilisent des colonnes contenant de la fibre de verre pour extraire l’ADN. QIAamp DNA mini kit (Qiagen) utilise des colonnes contenant des membranes de silice, qui sont capable de retenir l’ADN de manière spécifique en ajustant le pH et les conditions salines. Agencourt DNAdvance Kit (Beckman Coulter) utilise la séparation magnétique.

Les kits disponibles pour l’extraction et la purification d’ADN à partir de cellules animales et de tissus sont mentionnés ci-dessous. Une revue de ces kits est présentée dans la Table 3.

1. AccuPrep Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer): Ce kit peut être utilisé pour extraire en moyenne 6 μg d’ADN à partir de 200 μl de sang humain et jusqu’à 20 μg d’ADN à partir de 5x10⁶ lymphocytes, 25-50 mg de tissus mammalien, ou 10⁴-10⁸ de cellules cultivées. Ce kit peut être utilisé pour extraire de l’ADN à partir de sang traité avec du citrate ou de l’EDTA. Ce kit n’utilise pas la méthode conventionnelle pour l’isolation d’ADN, et ne nécessite pas d’extraction au phénol/chloroforme, de précipitation à l’éthanol etc. Les tissus sont d’abord homogénéisés à l’aide d’un mortier. Ce kit utilise des colonnes de fibre de verre qui lient l’ADN de manière spécifique en présence de sels chaotropes. Après l’élimination des contaminants par lavage, l’ADN est élué dans une solution de concentration faible en sels.
2. Arcturus® PicoPure® DNA Extraction Kit (Arcturus® PicoPure® DNA Extraction Kit, LifeTechnologies-Invitrogen): Ce kit peut être utilisé pour de faible quantité de cellules ou tissue. Ce kit utilise la technique IR laser-enabled laser capture microdissection (LCM) idéale pour la microdissection de cellule unique ou d’un petit nombre de cellules.
   L’ADN peut être extrait et amplifié dans le même tube ce qui évite la perte d’ADN et augmente la quantité d’ADN isolé. Il ne nécessite pas de solvants organiques ou de colonnes de centrifugation. Bien que les échantillons peuvent être préparés par plusieurs méthodes, les meilleurs résultats sont obtenus à partir de section de tissus fixés à la formaline et incorporer dans la paraffine (FFPE), des sections de tissue congelés, cellules fixées à l’éthanol, frottis cytologiques et culot cellulaires frais ou préalablement congelés.
3. GFX Genomic Blood DNA Purification Kit, Amersham Bioscience (GE Healthcare): Ce kit peut être utilisé pour la purification d’ADN à partir de sang, de couche leuco-plaquettaire, moelle osseuse, globules rouges nucléés, cultures cellulaires, lymphocytes et cellules buccales. Il est adapté pour les applications qui nécessitent jusqu’à 15 µg d’ADN génomique et utilise des colonnes remplies de matrice de fibres de verre. Le kit fournit trois méthodes de purification: 1) la méthode directe pour traiter jusqu’à 100 µl de sang, 2) la méthode adaptable pour traiter jusqu’à 1 ml de sang ou de moelle osseuse et jusqu’à 50 µl de couche leuco-plaquettaire, et 3) la procédure pour cultures cellulaires et lymphocyte qui traite jusqu’à 5x10⁶ de cellules cultivées ou jusqu’à 1x10⁷ lymphocytes.
4. InnuPrep DNA minikit (AJ I33nnuscreen): Ce kit permet l’isolation d’ADN génomique à partir d’échantillons de tissu (jusqu’à 50 mg), de queues de rongeurs (0.5–1 cm), d’échantillons de tissus fixés et inclus en paraffine et de cellules eucaryotes (5x10⁶ cellules). Ce kit est basé sur la technologie Dual Chemistry (DC) brevetée, qui combine un tampon de lyse avec un nouveau tampon de liaison qui aide à minimiser le temps requis pour la purification de l’ADN, ceci avec des colonnes de centrifugation avec filtre. Apres l’étape initiale de lyse, l’extraction est complétée en moins de 8 minutes. Produits associés: InnuPREP DNA Micro Kit, InnuPREP DNA/RNA Mini Kit.
5. QIAamp DNA mini kit (Qiagen): Ce kit permet l’extraction d’ADN génomique mitochondrial, bactérien, de parasite, ou viral à partir de tissus humains, prélèvements (buccaux, de l’œil, nasal, pharyngien, et autres), CSF, sang, fluides corporels, et cellules lavées provenant de l’urine. Le tissu est lysé enzymatiquement. Produits Associés: QIAamp DNA micro kit [3], QIAamp DNA blood mini kit [7] [8] [9], QIAamp DNA stool mini kit [10] [11] [12], QIAmp DNA Blood Midi kit [13] and Blood Maxi Kit [14].
6. AllPrep DNA/RNA Mini Kit (Qiagen): Il peut être utilisé pour extraire de l’ADN à partir de cellules (jusqu’à 10⁷ cellules) ou de tissus (jusqu’à 30 mg). Ce kit permet la purification simultanée d’ADN génomique et d’ARN total à partir d’une cellule unique ou d’échantillons de tissu, par l’utilisation respective des nouvelles colonnes novel AllPrep DNA spin, et de la colonne RNeasy Mini spin. Produits Associés: AllPrep DNA/RNA Micro Kit.
7. Agencourt DNAdvance Kit (Beckman Coulter): C’est un kit d’isolation d’ADN génomique haut débit pour l’isolation d’ADN à partir d’échantillons de tissus mammaliens frais ou congelés. Il utilise la technologie de billes paramagnétiques SPRI® brevetée par Agencourt pour l’isolation de l’ADN génomique (ADNg). Cette procédure est réalisée dans un format 96 puits et est adaptée à l’automatisation.

Comme mentionné ci-dessus, les étapes de base de l’isolation d’ADN doivent être modifiées pour prendre en compte les caractéristiques des tissus et cellules de végétaux utilisés. Les produits chimiques ou enzymes utilisés pour lyser les cellules microbiennes n’ont probablement pas la même efficacité pour les cellules végétales. Par exemple, le lysozyme est souvent fourni dans les kits de pour lyser les cellules bactériennes mais n’a aucun effets sur les cellules végétales. De plus, le contenu biochimique des cellules végétales est très différent de celui des microorganismes et des cellules animales. Beaucoup d’espèces de plantes présentent un contenu élevé en polysaccharides et polyphénols qui ne peuvent pas être éliminés par l’extraction au phénol (contrairement aux microbes). Des méthodes différentes de celles utilisées pour les microbes doivent donc être fournies dans les kits pour prendre en compte les caractéristiques particulières des cellules végétales.

Une des méthodes est d’utiliser un détergent appelé cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) qui forme un complexe insoluble avec les acides nucléiques et précipite l’ADN sélectivement, en laissant en solution les carbohydrates, protéines et autres composants contaminants. Le précipité contenant l’ADN est décomplexé par dissolution dans une solution de NaCl 1N. CTAB peut être inclus dans n’importe quelles étapes du procédé d’extraction. Pour éliminer les polyphénols, des concentrations plus élevées de CTAB avec du polyvinylpyrrolidone (PVP) du polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) peuvent être employées.

Une autre méthode est d’utiliser le thiocyanate de guanidium (GITC), qui aide à la purification de l’ADN à partir de matériel végétal de deux facons.1) Il dénature et dissout les protéines, désintègre les structures cellulaires et dissocie les nucléoprotéines de l’acide nucléique. Du fait de cette propriété, GITC peut être utilisé pour libérer l’ADN de Presque tous types de tissus. 2) L’ADN se lient fortement aux particules de silice en présence de GITC. Cette propriété peut être utilisée pour séparer l’ADN des protéines dénaturées ou d’autres composants biochimiques ou cellulaires. Généralement, les particules de silice sont placées dans des colonnes de chromatographie et l’extrait d’ADN traité au GITC y est déposé. L’ADN se lie sélectivement à la colonne et peut être élué dans la dernière étape après l’élimination des contaminants cellulaires par lavage.

L'acide ascorbique, l’acide diethyldithiocarbmin et le 2-mercaptoethanol peuvent être inclus dans certaines méthodes d’extraction de l’ADN, pour protéger l’ADN contre l’oxydation et la dégradation. L’ARN peut être éliminé à l’aide de RNase. La qualité de l’ADN isolé dépend surtout des conditions physiologiques du matériel végétal plutôt que du kit utilisé.

Les kits disponibles pour l’extraction d’ADN à partir de matériel végétal sont présentés ci-dessous. Une revue de ces kits est présentée dans la Table 4. Voir aussi les kits qui peuvent être utilisés pour les cellules mammaliennes, microbiennes et végétales.

1. NucleoSpin 8 Plant and NucleoSpin 96 Plant II (Clontech): Ces kits peuvent être utilisés pour l’isolation d’ADNg à partir de tissus et cellules de végétaux, adaptés aux applications de PCR, Southern blotting, ou n’importe quelles réactions enzymatiques. Permet aussi l’isolation en parallèle d’ADNg rapide grâce à un système de bandes 8 puits et un format de plaque de 96 puits haut débit. Après l’homogénéisation du matériel végétal, le protocole de ce kit utilise un tampon de lyse contenant du CTAB, permettant la lyse du matériel végétal. Un tampon de lyse contenant du SDS est aussi fourni comme alternative. Après l’élimination des polysaccharides, contaminations, et des débris cellulaires résiduels, le lysat contenant principalement l’ADN est déposé sur la membrane de silice pour la purification. Finalement, l’ADN est élué dans le tampon d’élution ou dans de l’eau distillée. La RNase est aussi fournie dans le kit pour l’élimination efficace de l’ARN de l’échantillon d’ADN.
2. DNeasy 96 Plant Kit (Qiagen): Ce kit peut être utilisé pour isoler jusqu’à 15 µg par puits d’ADN cellulaire total à partir de matériel végétal comme les cellules végétales, du tissu végétal et des champignons. DNeasy Plant Mini Kit peut traiter jusqu’à 100 mg de tissue, le DNeasy Plant Maxi Kit peut traiter jusqu’à 1 g de tissu. Brièvement, le matériel végétal est homogénéisé puis incubé dans le tampon de lyse contenant la RNase. Après la lyse, les protéines et les polysaccharides sont précipités en solution saline. Les débris cellulaires et les précipités sont éliminés à l’aide de colonnes QIAshredder. L’échantillon est ensuite appliqué sur une membrane de silice placée dans des colonnes de centrifugation, et, après quelques étapes de lavages, l‘ADN est élué dans une solution faible en sels ou dans de l’eau. Disponible dans le format de plaque 96 puits, produit des rendements d’ADN cellulaire total élevés et reproductibles. Produits Associés: DNeasy Plant Mini Kit.
3. Nucleon PhytoPure Genomic DNA Extraction Kits (GE Healthcare): Ce kit peut être utilisé pour isoler de l’ADN à partir d’échantillons de plantes frais, congelés ou lyophilisés ainsi qu’à partir d’échantillons fongiques. Ce kit utilise un protocole unique utilisant la résine exclusive Nucleon PhytoPure propriété de GE Healthcare qui lie spécifiquement les polysaccharides. Le système d’extraction d’ADN Nucléon Phytopure suit un protocole relativement simple qui ne requiert pas de phénol ou de cetyltrimethylammonium bromide (CTAB). Brièvement, la paroi cellulaire est désorganisée et les cellules sont lysées dans un réactif qui contient du potassium SDS. Le SDS est utilisé pour son habilité à former des complexes avec les protéines et polysaccharides. Ensuite, du chloroforme est ajouté avec la résine spécialement modifiée Nucleon PhytoPure, qui lie les polysaccharides de manière covalente. De l’ADN de très bonne qualité est obtenu dans la dernière étape. En plus du chloroforme, cette procédure utilise de l’isopropanol froid et de l’éthanol 70%.

Les kits pouvant être utilisés pour l’extraction d’ADN de sources mammaliennes et à partir de microorganismes sont décrits ci-dessous. Une revue de ces kits est présentée dans la Table 5.

1. DNA Isolation Kit for cells and tissues (Roche): Ce kit pour l’extraction d’ADNg à partir de tissus (jusqu’à 1g), de cellules cultivées (jusqu’à 10⁷), de cellules bactériennes (jusqu’à 1011) et de levures. Evite l’utilisation de l’extraction organique, les colonnes d’échanges d’anions et les réactifs chaotropes. Il fournit de l’ADNg de taille allant de 50 à 150 kb, et la procédure peut être terminée en environ 2.5 heures.
2. Purelink Genomic DNA extraction kit (Invitrogen): Ce kit permet l’isolation d’ADN à partir d’un large éventail de tailles d’échantillons pour le sang (de 100 µl à 1 ml), tissus, cellules, bactéries, prélèvements, buccaux, taches de sang séché, tissus FFPE, et les échantillons préservés dans Oragene™. Il est basé sur la technologie de membrane de silice. Ce kit permet une plus grande flexibilité incluant une version en plaque 96 puits qui ne nécessite aucun équipement spécial et peut être utilisé manuellement ou sur les plateformes automatisées.
3. DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen): Ce kit peut être utilisé pour isoler de l’ADN total (génomique, mitochondrial, et pathogène) à partir d’une variété d’échantillons frais ou congelés, fixés à la formaline ou tissus ou cellules d’origine animale inclus en paraffine, queues de rongeurs, sang, bactéries, levures, cheveux, insectes etc. Permet la purification d’ADN de taille allant jusqu’à 50 kb, avec des fragments de 30kb prédominants. Permet l’isolation efficace de fragments d’ADN de petite taille, 100 bp. Ce kit utilise la technologie basée sur la silice, ou les membranes de silice liant spécifiquement l’ADN sont empaquetées dans des colonnes de centrifugation. Aprés la lyse cellulaire, l’extraction d’ADN est complétée en environ 20 minutes.
4. Genomic DNA from Tissue kit (NucleoSpin® Tissue XS kit), Macherey Nagel: Ce kit peut être utilisé pour l’isolation d’ADNg à partir de tissus (par exemple, rein de souris, LCM), cellules (bactéries, levures, cellules en culture), échantillons cliniques (biopsies, ponctions à l'aiguille fine) et d’échantillons médico-légaux (taches de sang séché, prélèvements buccaux, empreintes digitales). L’avantage principal de ce kit est qu’il permet l’obtention d’ADN de façon reproductible et fiable même à partir de faibles quantités d’échantillon comme 10 cellules préparées par LCM et peut également être utilisé pour des échantillons plus larges, jusqu’à plusieurs milligrammes de tissu ou de culot cellulaire. Ce kit utilise aussi la technologie basée sur la membrane de silice. Produits associés: NucleoSpin® Tissue, NucleoBond® AXG, NucleoSpin® 8 Tissue Core kit, NucleoSpin® 96 Tissue Core kit.

Les kits pouvant être utilisés pour l’extraction d’ADN à partir de la plupart des sources telles que les sources mammalienne, microbienne et végétale sont décrits ci-dessous. Une revue de ces kits est présentée dans la Table 6.

1. ArchivePure DNA purification kit (5Prime): Ce kit est utilisé pour purifier de l’ADN génomique, mitochondrial ou viral à partir de sang et moelle osseuse, cellules en culture, tissus animaux et végétaux, bactéries gram-négatives, bactéries gram-positives et levures. Système de purification de l’ADNg en phase liquide qui utilise des détergents non toxiques et des sels. 95% de l’ADN purifié présente une taille supérieure à 50kb, généralement autour de 100-200 kb.
2. FastDNA Kit (MP Biomedicals LLC): Il permet l’extraction d’ADNg à partir de tissus végétaux et animaux, de cellules en cultures, bactéries, levures, champignons, algues, virus et insectes. Il utilise des tubes Lysing Matrix optimisés et la procédure GeneClean® basée sur l’utilisation de silice pour purifier l’ADN.
3. DNAzol® Reagent (Invitrogen): Ce réactif peut être utilisé pour isoler de l’ADNg à partir d’échantillons solides ou liquides d’origine animale, végétale, de levure ou bactérienne. Il est conçu pour l’utilisation avec les tissus, cellules ou le sang. C’est un réactif complet prêt à l’emploi.
4. Easy-DNA™ Kit (Invitrogen): Ce kit peut être utilisé pour l’isolation d’ADNg de haut poids moléculaire à partir de différents types de cellules et tissus comme les tissus mammaliens, le sang, les follicules capillaires, les queues de souris, d les feuilles de plantes, les levures et les cellules E. Coli. Il est basé sur une modification de la méthode d’extraction organique. Il utilise le chloroforme pour éliminer les contaminants et l’éthanol pour précipiter et isoler l’ADN.
5. Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega): Ce kit peut être utilisé pour l’isolation de l’ADN à partir de sang, globules blancs, cellules en culture, tissu animal, tissu végétal, levure et bactéries Gram-positives et Gram-négatives. Brièvement, les cellules sont d’abord lysées, puis les protéines cellulaires sont éliminées par addition de sels, l’ARN est éliminé par traitement à la RNase et finalement l’ADN est précipité à l’aide d’isopropanol.
6. DNA Isolation Kits (BioBasic) (Animal tissue & fungi genomic DNA extraction prep kit, Bacteria genomic DNA prep kit, Blood genomic DNA prep kit, Plant genomic DNA prep kit, Yeast genomic DNA extraction prep Kit) Les kits BioBasic peuvent être utilisés pour l’isolation d’ADN à partir de sang, tissu végétal, cellules et tissus mammaliens, bactéries et champignons [32].

Des kits sont aussi disponibles pour l’isolation d’ADNg à partir de sang tels que:

1. DNA Isolation Kit for mammalian blood (Roche): Ce kit peut être utilisé pour l’extraction d’ADNg à partir de 1-10 ml de sang humain, de souris ou de rat. Il peut également être utilisé pour l’extraction d’ADN à partir d’échantillons de couche leuco-plaquettaire ou de lymphocytes. Le rendement moyen obtenu avec ce kit est d’environ 350 µg/10 ml, allant de 200–700 µg à partir de sang provenant d’une personne en bonne santé (moyenne de 5x10⁶ leucocytes/ml). Il produit un ADN adapté pour la PCR, le séquençage, et le Southern blot. Les avantages de ce kit incluent le temps de préparation court (moins de 1.5 heures), le ratio A260/A280 de l’ADN isolé est généralement de 1.7–1.9 [41].
2. InnuPREP Blood DNA Mini Kit, (AJ Innuscreen): Ce kit permet l’isolation directe d’ADNg à partir de volume de sang allant jusqu’à 300 µl. Il produit de hauts rendements jusqu’à 12 µg en fonction de l’échantillon et de la quantité utilisée. Les avantages de ce kit sont: la production d’un ADN de haute qualité, la facilité d’utilisation, la certification pour l’utilisation pour les diagnostics in vitro (CE-IVD). Produits associés: InnuPREP Blood DNA Master Kit, InnuPREP Blood DNA MIDI Kit, InnuPREP Blood DNA MIDI Direct Kit.

D’autres kits sont également disponibles pour 1) préparer de l’ADN utilisable pour des applications telles que “ next-generation sequencing” et la préparation de librairies d’expression, 2) purifier de l’ADN double brin amplifié par PCR et 3) créer une librairie de fragments à partir d’un échantillon d’ADN. Ces kits sont:

1. NEBNext DNA Sample Prep Reagent Set 1 (New England Biolabs): Ce kit est composé d’enzymes et de tampons utilisés pour la préparation d’échantillon pour le “next-generation sequencing”, et pour la préparation de librairie d’expression. Les composants de ce kit sont contrôlés pour chaque lot, individuellement et par groupe de réactifs. Les réactifs passent par des contrôles de qualité additionnels et sont validés fonctionnellement pour assurer un rendement maximum. Les avantages principaux de ce kit incluent: disponibilité en lot, master mix et modules; tous les réactifs sont sujet à des contrôles qualité rigoureux pour assurer une qualité et une pureté maximale; et chaque lot ou module de réactifs est validé fonctionnellement. De plus, il permet la préparation d’échantillons d’ADN pour le “next generation sequencing”, la construction de librairie d’expression, les arrays d’hybridation de haute densité (SPRS2 and SPMMS2) et les méthodes d'hybridation par soustraction (SPRS2 and SPMMS2) [42] [34].
2. Wizard® PCR Preps DNA Purification System (Promega): Ce kit est utilisé pour purifier de l’ADN double-brins amplifié par PCR. Les produits de PCR sont efficacement purifiés des contaminants comme les dimères d’amorces de PCR et les amorces amplifiées. Il fournit un rendement supérieur à 95% lorsqu’une quantité de 50 ng à 16 μg de produit de PCR de 500 bp est appliqué à 1 ml of résine. Les rendements typiques de 70–90% pour des fragments de 500bp sont généralement obtenus avec une purification à partir de low-melting-temperature agarose. les avantage de ce kit sont: méthode de purification directe en 15-minute, procédé simple et rapide, et relativement peu cher [43].
3. GS FLX Titanium Rapid Library Preparation Kit (Roche): Ce kit est composé de réactifs pour la création de librairies de fragments d’échantillons d’ADN devant être séquencé, comme l’ADNg d’un organisme d’intérêt. La méthode nécessite l’apport initial de 500 ng d’ADN, qui peut être double brin, qui présente un ratio A260/A280 d’environ 1.8 et une concentration d’au moins 5 ng/µl. La librairie finale sera composée d’un set de fragments d’ADN simple brin représentant la séquence complète de l’échantillon de départ. Chaque fragment est flanqué d’adaptateurs d’amplification et de séquençage d’ADN adaptés. Les fragments sont ensuite purifiés et quantifiés. Les avantages principaux sont que la technologie est adaptée au séquençage de génomes de n’importe quelle taille et que la procédure peut être effectuée par une seule personne dans un laboratoire adéquat équipé [44].