Résumé

Siemens a développé un procédé entièrement automatisé de purification des acides nucléiques qui prend en charge l'analyse de routine de diagnostic clinique dans le laboratoire de pathologie moléculaire, et ainsi ouvre la voie à d'importantes études rétrospectives de bio marqueurs avec matériel tissulaire archivé fixé au formol, inclus en paraffine (FFPE) et un suivi des données cliniques sur le long-terme.

Les principales caractéristiques de ce système d'extraction entièrement automatisé sont:

• La technologie unique de particules magnétiques (bille de taille <1 um) revêtues d'une nano couche de silice
• Haut débit pouvant aller jusqu'à 48 échantillons FFPE en moins de 4 heures
• Co-extraction de l'ARN et l'ADN d'un échantillon FFPE (avec option automatisée de l’étape de digestion DNase I)
• De-paraffination entièrement intégrée par absorption hydrophobe (Pas d’étapes xylène/ éthanol)

Contenu

L'identification et la validation de marqueurs moléculaires tissulaires fixés au formol, inclus en paraffine (FFPE) est actuellement un domaine d'activité de recherche intense et passionnant. Cela est dû en partie au fait que le profilage d'expression, le génotypage et l'analyse de mutation ont démontré leur aide au diagnostic et ont fourni des orientations, en particulier dans le traitement du cancer. Malgré cet effort concentré, à ce jour, seul un nombre limité de marqueurs individuels ou de panels utilisant les marqueurs extraits des acides nucléiques à partir d'échantillons de tissus histopathologiques ont été introduits dans la pratique clinique de routine (par exemple, OncotypeDX®; analyse des mutations K-ras pour EGFR basé sur des thérapies ciblées). FFPE est un outil précieux dans la recherche, l’interprétation de l'ADN, l'ARN et des bio marqueurs micro ARN parce que FFPE est facilement accessible grâce au diagnostic clinique de routine. La facilité logistique et un accès simple aux grandes archives de tissu FFPE d'entités de diverses maladies liées à la clinique et au suivi des bases de données rendent ce matériau comme particulièrement attractif.

L'expression des protéines dans les échantillons pathologiques par détection immunohistochimique (IHC) est bien établie et fait actuellement partie du diagnostic de routine. En revanche, les analyses utilisant l'ADN et, en particulier, de l'ARNm extrait de tissu FFPE reste difficile parce que le processus de fixation introduit des liaisons croisées entre protéines et acides nucléiques. Ces liaisons modifient chimiquement de nombreuses molécules et des fragments des acides nucléiques. En outre, de nombreuses méthodes pour l'extraction d'acides nucléiques à partir de tissu FFPE, en particulier ceux qui sont très manuel, ne sont pas des protocoles normalisés (par exemple, ils comprennent des temps de lyse variables et des chimies différentes pour l'extraction de l'ARN et l'ADN). De plus, ces protocoles manuels consomment beaucoup de temps et nécessitent l'utilisation de matières dangereuses et inflammables comme le xylène et l'éthanol pour le déparaffinage. Ces facteurs ont nécessité une adaptation individualisée pour créer des protocoles normalisés. En conséquence, ces protocoles de séparation ont été incompatibles avec les formats de haut-débit.

Les difficultés d'isoler les acides nucléiques à partir des échantillons de tissu FFPE ont été traités par Siemens avec le développement d'une méthode entièrement automatisée pour une utilisation en pathologie moléculaire et les tests de diagnostic, les deux applications en routine de diagnostic clinique ainsi que pour la recherche.

Le fond de cette technologie est la propriété des particules paramagnétiques (PMP) recouvertes de silice, développée par Siemens. Ces PMP, produites en utilisant un procédé de fabrication simple et robuste, simplifient et améliorent l'isolement automatique d'acides nucléiques en vertu des propriétés des particules, en particulier les nano couches de silice absorbées sur les particules. La figure 1 montre une comparaison des PMP Siemens par rapport à d'autres billes disponibles dans le commerce. Les acides nucléiques sont liés de manière sélective dans des conditions chaotropiques (sélection positive), mais "la saleté ou des débris de tissu" sont également engagés dans des conditions non chaotropiques les excluant de cible (sélection négative; voir ci-dessous). Le comportement de la suspension optimale des particules est dû à leur très petite taille, la distribution des particules de taille homogène, et aux fortes propriétés magnétiques. Une chimie d’extraction universelle qui englobe la lyse, le lavage et les étapes d'élution a été développée pour extraire efficacement l'ADN et l'ARN en même temps avec un taux de récupération et une pureté élevés l au sein d'un large éventail de types d'échantillons (figure 2).

Un avantage majeur de la méthode d'extraction des tissus FFPE Siemens est le flux de travail qui prévoit l'intégration complète de l'étape dé-paraffination dans la procédure d'extraction au sein d’un processus qui est entièrement automatisé. L'étape de dé-paraffination fonctionne grâce à une absorption simple et efficace de la paraffine fondue hydrophobe à la paroi interne du tube échantillon en polypropylène pendant le processus de lyse. Cette étape ne remplace pas seulement les nuisibles et laborieuses étapes de traitement xylène/éthanol, mais supprime également la nécessité d'une centrifugation. Ainsi, le procédé Siemens se prête davantage à une automatisation complète. Il permet également le chargement des coupes FFPE immédiatement après la coupe microtome.

Avec des échantillons FFPE "solides", l'apport des tissus est difficile à normaliser parce que la composition cellule/ matrice, la fixation, et les conditions de stockage peuvent être très différentes. À la suite de nombreuses autres méthodes nécessitent des temps d'incubation variables pour obtenir une lyse complète. Une autre caractéristique essentielle de la technologie Siemens est la capacité des PMP, en l'absence de sels chaotropiques, de lier et d'éliminer tous les tissus non digérés (débris) (que l’on peut attribuer à une sélection négative). Cette sélection négative est une exigence clé pour l'automatisation efficace et complète de tout matériel insoluble qui peut interférer avec la manipulation de liquides précis et entraîner l'obstruction des embouts de pipette.

La plateforme Siemens utilise du matériel spécialisé qui assure le chargement et la lyse des coupes FFPE dans des tubes en plastique de 1.5 ml qui sont chargés directement sur le système. Le système permet un débit de 48 échantillons en moins de 4 heures, incluant une étape de 30 minutes d'incubation pour la digestion de la DNase I lors de l'isolement de l'ARN purifié (avec 8 échantillons traités en 3h 15min). Si l'ADN est le résultat souhaité, la durée totale de traitement de 48 échantillons est réduite à 2h 40 min, car l'étape DNase I n'est pas nécessaire. La chimie d'extraction universelle permet l'isolement d'ADN et d'ARN à partir du même échantillon. Une simple requête logicielle applique l’étape automatisée de digestion DNase I pour l'analyse de l'expression exacte. Pour les applications ADN typiques telles que les mutations et l'analyse du polymorphisme par séquençage ultra profond ou classique, l'acide nucléique total contenant l’éluat peut être appliqué.

L'extraction entièrement automatisée peut traiter différents formats d'échantillon, y compris les coupes FFPE standard, des tissus minuscules tels les Tissue Micro Array (TMA), et des coupes fixées de biopsies réalisées avec une aiguille. Même si le laser capture des microdissections de cellules, tissus congelés et des cellules de culture, ceux-ci peuvent être utilisés pour l'extraction.

En plus des avantages de l'automatisation du flux de travail complet avec un débit élevé, la méthode récupère également de grandes quantités d'ADN et d'ARN avec une excellente pureté. Le taux de réussite pour extraire une PCR détectable d’ARN ou d'ADN à partir de plusieurs milliers d'échantillons FFPE vieux de 30 ans a été démontré à env. 99% (réf 1, 2, 3,4). Un éluat standard de 100 μl permet normalement d'exécuter avec succès des centaines de réactions PCR d'une coupe de tissu.

Globalement, la méthode d’extraction d'acide nucléique entièrement automatisée Siemens fournit un certain nombre d'avantages par rapport aux méthodes d'extraction les plus modernes d'autres fabricants. Les principaux avantages comprennent l'automatisation complète, y compris une étape intégrée de dé-paraffination sans xylène, le débit élevé jusqu'à 48 échantillons en moins de 4 heures, une chimie d'extraction consolidées et universelle pour Co-isolement de l'ADN et l'ARN, un temps de lyse normalisée de une heure, une étape de sélection négative de tissu contournant une centrifugation , souplesse en ce qui concerne le type de tissu et le format, supérieure reproductibilité, la réduction du risque de contamination et la compatibilité avec les technologies de dosage comme la cinétique (RT-) PCR, PCR en point final, le séquençage et les puces. La méthode de purification des acides nucléiques Siemens ouvre la voie à d'importantes études rétrospectives de bios marqueurs avec matériel tissulaire archivé fixé au formol, inclus en paraffine (FFPE) et un suivi des données cliniques sur le long-terme. En outre et surtout, il prend en charge l'analyse de routine de ce matériel dans le laboratoire de pathologie clinique ou moléculaire.

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Figures

Figure 1: Les images en microscopie électronique des billes magnétiques Siemens d’oxyde de fer recouvertes d'une nano couche de silice (à gauche) par rapport à la silice typique contenant des particules magnétiques provenant d'autres fabricants (à droite). Notez l'échelle différente de l’image.

Figure 2: Schéma du flux de travail de l'ADN entièrement automatisé et la procédure d'isolement d'ARN pour des coupes de tissus FFPE dont deux étapes de sélection négative automatisées pour la paraffine et l'enlèvement des débris de tissu. Notez que l’étape automatisée de digestion de la DNase I est facultative

REFERENCES:

1. Kerstin Bohmann, Guido Hennig, Uwe Rogel, Christopher Poremba, Berit Maria Mueller, Peter Fritz, Stephan Stoerkel and Karl-L. Schaefer. RNA Extraction from Archival FFPE Tissue: A Comparison of Manual, Semi-automated and Fully Automated Purification Methods. Clinical Chemistry, 2009; 55:9; 1719-1727
2. Petry C, Gehrmann M, von Torne C, Weber K, Stropp U, Hennig G. Predictive and prognostic markers of breast cancer: Molecular biological analysis of fixed tumor tissue. Pathologe. 2008 Nov; 29 Suppl 2:181-3
3. Berit Maria Muller, Ralf Kronenwett, Guido Hennig, Heike Euting, Karsten Weber, Kerstin Bohmann, Wilko Weichert, Klaus-Jurgen Winzer, Glen Kristiansen, Christoph Petry, Manfred Dietel, Carsten Denkert. Quantitative determination of estrogen receptor, progesterone receptor and HER2 in formalin-fixed paraffin-embedded tissue - a new option for predictive biomarker assessment in breast cancer. Diagnostic Molecular Pathology 2010 in press
4. G. Hennig, M. Gehrmannn, U. Stropp, H. Brauch, P. Fritz, M. Eichelbaum, M. Schwab, W. Schroth. Automated extraction of DNA and RNA from a single formalin-fixed paraffin-embedded tissue section for analysis of both single-nucleotide polymorphisms and mRNA expression. Clinical Chemistry, 2010; 56:12; 1845-1853