Cet article est une revue des systèmes vecteur-hôte les plus communément utilisés pour l’expression de protéines, basée sur la base de données PDB avec des informations sur l’expression de protéines provenant de plus de 30,000 publications et une revue de 424 publications choisies de manière aléatoire par Labome.

Les avantages, désavantages et applications potentielles d’un bon nombre de systèmes d’expression de protéines recombinantes sont détaillés dans la Table 1. De nombreuses publications fournissent des information détaillées sur ces systèmes: Escherchia coli [1] [2] [3] [4] [5] [6] ; Saccharomyces cerevisiae [7] [4] [8] [9] ; Pichia pastoris [10] [11] [5] [8] [9] ; baculovirus/ cellules d’insecte [1] [12] [5] [13] ; lignée cellulaires mammaliennes [5] ; et les systèmes de production de protéines in vitro/acellulaires [14].

La Table 1 résume les propriétés fondamentales de ces systèmes d’expression. Les chercheurs travaillent activement à améliorer ces propriétés (voir [19] pour une revue récente). Un nombre de souches E. Coli qui permettent d’éliminer le problème de codon, (Rossetta, CodonPlus ril/rp), la formation inefficace des ponts disulfures (SHuffle, Origami, [20]) et la faible expression de protéines membranaires (C41 et C43), sont maintenant commercialement disponibles. De même, les vecteurs d’expression E. coli utilisant des tags tels que SUMO, Maltose Binding Protein et thioredoxine conçus pour permettre l’expression de protéines solubles sont disponible commercialement. La pré-expression de la sulfhydrile oxydase peut augmenter de manière signifiante la formation des ponts disulfures [21]. Ces approches marchent bien avec certaines protéines mais pour d’autres il est encore impossible d’obtenir l’expression de protéines fonctionnelles solubles dans E. Coli [22] [20]. Des souches E. Coli ont même été conçues pour réaliser les N-glycosylation sur les protéines cependant le rendement est faible [23] [19]. De même, des approches sont développées pour exprimer des protéines avec des glycosylations plus ressemblantes aux glycosylations mammaliennes dans le système bacculovirus/cellules d’insectes et de cette façon, diversifier son utilité [24]. Des variants de Bacculovirus permettant une meilleure sécrétion de protéines sont aussi développés [19].

Le problème clé auquel les chercheur font face est qu’il est toujours impossible de prédire quel système d’expression va le mieux fonctionner pour une protéine particulière ou pour une utilisation finale particulière. Un système d’expression applicable universellement n’existe pas encore [25]. Lorsque le chercheur sélectionne un système d’expression particulier, il doit garder en tête les propriétés fondamentales de chaque système, leurs avantages et désavantages et comment n’importe quelle limitation particulière du système peut être éliminée. Les décisions doivent être prises en tenant compte des connaissances sur la protéine d’expression cible et des membres de la même famille et sur l’utilisation finale de la protéine recombinante. Si les ressources le permettent, il est prudent de tester deux systèmes d’expression (ou plus) en parallèle.

Malgré le manque de modifications post-traductionnelles et le besoin d’éliminer les endotoxines des protéines exprimées chez Escherichia coli avant leur utilisation in vivo, le système E. coli est le système le plus populaire pour la production de protéines recombinantes dans l’industrie pharmaceutique. En 2009, 29.8% des protéines recombinantes biopharmaceutiques approuvées par la FDA/EMEA ont été produites dans Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae (18.5%) et les cellules mammaliennes (39%) étaient également des hôtes populaires [4].

Il est intéressant de noter que le RIKEN Structural Genomics Initiative au Japon a concentré ses efforts sur l’utilisation de systèmes acellulaires (transcription/traduction in vitro) pour générer des protéines dans le but de déterminer leur structure protéique [26] [3], Ceci démontre la capacité des systèmes d’expression acellulaires modernes.

Les aspects clés de l’expression de protéines pour la biologie structurale ont récemment été revus dans une édition spéciale de Current Opinion in Structural Biology [Curr Opin Struct Biol (2013) 23 (3), 1- 416 New constructs and expression of proteins].

Cet article se concentre plus particulièrement sur les systèmes vecteur-hôtes les plus communément utilisés. Ce sont les systèmes généralement choisis en premier quand on projette d’exprimer une protéine recombinante. Cependant, beaucoup d’autres systèmes d’expression, plus ésotériques, sont disponibles. Ceci peut être intéressant pour les chercheurs avec expérience en expression de protéine ou, lorsque les systèmes d’expression les plus populaires ne répondent pas aux besoins d’une expérience particulière. A titre d’exemple, les systèmes microbes/cellules végétales ont été décrits: levures (Hansenula polymorpha, Arxula adeninivorans, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Schizosaccharomyces pombe [8] ); bactéries (Baccillus brevis, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis and Caulobacter crescentis [2], Corynebacterium [27], hyperthermophilic sulfolobus islandicus [28] ); et algues. Pour une revue récente des systèmes d’expression alternatifs/ moins communs utilisés en biologie structurale voir [29].

Les vecteurs d’expression viraux suivants sont disponibles pour l’expression de protéines recombinantes en cellules mammaliennes: Semliki Forest Virus [30] ; Lentivirus [31] ; et Adénovirus [32]. Semliki Forest Virus est couramment utilisé pour l’expression de protéines membranaires pour le développement thérapeutique et les études de structure protéique [30]. Les vecteurs Lentiviraux et adénoviraux sont actuellement très intéressants dans le domaine de la thérapie génique [33] [34]. Il existe également un intérêt certain pour la production de protéines recombinantes thérapeutiques dans le lait d’animaux transgéniques [35].

La Worldwide Protein Data Bank (wwPDB: http://www.wwpdb.org/) est le résultat de la collaboration de quatre organisations: RCSB PDB (USA: http://www.rcsb.org/); MSD-EBI (Europe: http://www.ebi.ac.uk/pdbe/); PDBj (Japan: http://www.pdbj.org/); and BMRB (USA). LA wwPDB est une librairie de données structurales macromoléculaires dont le but est de maintenir une seule banque de données structurales macromoléculaires librement et publiquement disponible à la communauté globale [36] [37]. Au 20 Juin, 2012 Il y avait 82499 structures dans la librairie. La vaste majorité des structures dans la wwPDB étaient des structures protéiques (Figure 1).

Figure 1. wwPDB structures par type de polymère. Les données proviennent du site internet de PBD le 20 Juin, 2012. Note: 96.1% des 3854 'mixed' polymères sont des mélanges protéine/ acide nucléique.

Les protéines dans la wwPDB ont généralement été exprimées de manière recombinante utilisant des vecteurs d’expression spécifiques et des hôtes d’expression. Avec l’aide de Rachel Kramer Green Ph.D., RCSB PDB, le 13 Mars 2012, Labome a téléchargé un document résumant l’ensemble des systèmes d’expression utilisés pour la production des protéines dont la structure est archivée dans la librairie PDB. Le document contient un nombre total de 197348 entrées. Il y a 75015 entrées PDB distinctes et 196595 PDB id distinctes et combinaisons. Des 197348 entrées, 162432 sont associées à des publications, avec un total de 32449 publications (PMID). Les 10 principaux organismes basés sur le nombre d’entrées dans wwPDB sont répertoriés dans la Table 2.

Le fait qu’Homo sapiens soit la source génique la plus commune reflète le désir de la communauté scientifique de comprendre le génome humain au niveau fonctionnel (protéines).

La majorité des entrées dans wwPDB citent Escherichia coli comme hôte d’expression avec 21850 sur 32449 publications (67.3%) indiquant son utilisation. La table 3 répertorie les 5 principaux hôtes d’expression et les 2 ou 3 principaux vecteurs d’expression utilisés pour chacun de ces organismes hôtes.

Il est important de noter qu Escherichia coli est l’hôte le plus communément utilisé dans la librairie wwPDB avec une marge considérable.

Eschericia coli est une bactérie Gram-négative, en forme de bâtonnet. C’est un modèle clé dans la recherche des sciences de la vie qui a été largement exploité dans les cadres académique et industriel. Il est important de noter que les lipopolysaccharides dans la membrane externe sont la source d’endotoxines, qui peuvent entrainer des réponses inflammatoires sévères dans les modèles expérimentaux cellulaires et in vivo.

Les cellules Spodoptera frugiperda utilisées sont des lignées cellulaires (Sf 9 and Sf 21) dérivés de tissue ovariens de Fall Armyworm.

Pichia pastoris est une levure respiratoire, méthyl trophique qui peut utiliser le méthanol comme sa seule source de carbone et d’énergie.

Les lignées cellulaires Cricetulus griseus proviennent de cellules d’ovaires de hamster chinois (CHO). Cette lignée cellulaire largement utilisée peut être adaptée à la croissance en suspension. La plupart des anticorps recombinants sont produits en cellules CHO.

Saccharomyces cerevisiae est une levure fermentante génétiquement modifiée qui a été largement étudiée. C’était la première levure à être utilisée en routine pour l’expression de protéines recombinantes.

Pour chaque hôte d’expression les 2 ou 3 vecteurs d’expression les plus souvent cités représentent seulement une faible proportion du nombre total de publication. (Table 3). Ceci reflète le large éventail de vecteurs d’expressions qui ont été utilisés pour chaque hôte d’expression.

Les Figures 2 et 3 présentent les cartes des plasmides pET28 et pcDNA3.3 (la dernière version de pcDNA3) respectivement. Ces plasmides sont les vecteurs d’expression archétype pour E. coli et les cellules mammaliennes, respectivement.

Dans les vecteurs pET, l’ARN polymérase T7 commande l’expression de la protéine recombinante. Le plasmide pET28 encode une séquence tag His/site de clivage thrombine/ tag T7 N-terminal et un tag His C-terminal optionnel. Ces vecteurs sont utilisés avec les lignées lambda DE3 lysogène d’E. coli. Dans ces lignées, l’expression d’une copie génomique de l’ARN polymérase T7 est sous le contrôle du répresseur Lac. L’expression de protéine recombinante est induite par addition d’isopropyl-b-D-thio-galactoside (IPTG) dans le milieu de culture. Il est intéressant de noter que les vecteurs pour lesquels l’expression est induite par d’autres molécules (e.g. arabinose) ne sont pas représentés de manière proéminente dans la librairie wwPDB.

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Figure 2. Carte du plasmide pET28. L’image pET28 provient d’EMD Millipore Corporation.

Dans le cas de la série de plasmides pcDNA3, l’expression est commandée par le promoteur précoce immédiat du cytomégalovirus humain (CMV). C’est un promoteur fort, constitutivement actif dans les cellules mammaliennes. pcDNA3 est la version originale de la série de vecteurs pcDNA3 et n’est plus disponible commercialement. Le dernier développement dans cette série de vecteurs est pcDNA3.3. Il doit également être noté que pcDNA3.1 a été identifié comme l’un des vecteurs d’expression mammaliens le plus souvent utilisé dans une revue de publications sélectionnées de manière aléatoire (voir ci-dessous).

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Figure 3. Carte du plasmide pcDNA3.3. L’image de pcDNA3.3 provient de Life Technologies Corporation.

Les vecteurs baculovirus/cellules d’insecte les plus communément utilisés, emploient tous le promoteur fort polyhedrin pour commander l’expression constitutive des protéines recombinantes. Les plasmides (vecteur de transfert baculovirus) ne commandent pas eux-mêmes l’expression des protéines. Ils sont utilisés pour générer le baculovirus recombinant qui contient le gène d’intérêt sous le contrôle du promoteur polyhedrin. pFastBac est la génération récente de plasmides qui utilisent la transposition site-spécifique pour générer le baculovirus recombinant. Ceci réduit le temps nécessaire à la génération du baculovirus recombinant à 2 semaines comparé aux 4-6 semaines requises avec les plasmides de génération précédente comme pVL1392/3 et pAcGP67.

Les vecteurs Pichia pastoris utilisent le promoteur fort AOX1. L’expression est induite par addition de méthanol. Bien que Pichia pastoris soit un excellent système pour l’expression de protéines secrétées (voir ci-dessous), les deux vecteurs d’expression les plus communément utilisés dans la librairie wwPDB sont conçus pour l’expression cytoplasmique.

Le plasmide Yep de Saccharomyces cerevisiae conduit l’expression via le promoteur de levure GAL1. L’expression est réprimée par le glucose et induite par le galactose.

Les données dans la Table 3 correspondent aux hôtes et vecteurs d’expressions utilisés spécifiquement pour la production de protéines dans le but d’étudier leur structure. En conséquence, ces données sont biaisées vers les systèmes hôtes/vecteurs capable de générer de grande quantité de protéines purifiées comme le requiert les études de structure 3D. L’incapacité de Escherichia coli a glycosyler les protéines et la facilité relative avec laquelle les N-glycosylations de cellules d’insectes peuvent être éliminées à l’aide d’enzymes contribuent à leur utilisation fréquente dans la librairie wwPDB. Les protéines non glycolysées sont généralement préférées pour les études structurales, à moins que les molécules de sucres soient essentielles à la fonction de la protéine d’intérêt.

Pour les autres applications (telles que les essais enzymatiques et cellulaires, la production d’antigène pour la génération d’anticorps, la surexpression pour étudier les fonctions cellulaires ou la localisation cellulaire) il n’est peut-être pas nécessaire d’exprimer et de purifier des quantités substantielles de protéines. En effet, pour les études en systèmes cellulaires la purification de protéines recombinante a peu de chance d’être considérée. Néanmoins, les données sur les systèmes hôtes/vecteurs d’expression obtenues à partir de la librairie wwPDB est une ressource précieuse. Ces données peuvent guider les projets d’expression de protéines pour beaucoup d’applications.

Pour éviter le biais potentiel des données provenant de la librairie wwPDB, Labome a revu 424 publications citant les plasmides, sélectionnées de manière aléatoire. Les 2 groupes de vecteurs d’expression les plus communément utilisés sont présentés dans la Table 4.

Comme pour les données obtenues de la librairie wwPDB, les vecteurs d’expression les plus souvent cités ne représentent qu’une faible proportion du nombre total de publications. Ceci reflète de nouveau la diversité de vecteurs d’expression que les chercheurs utilisent pour un système hôte donné.

pcDNA3.1 commande l’expression dans les cellules mammaliennes via le promoteur constitutif CMV (voir ci-dessus).

Similairement, pEGFP est un vecteur d’expression mammalien dans lequel l’expression est conduite de manière constitutive par le promoteur CMV. L’Enhanced green fluorescent protein (EGFP) est exprimée soit comme protéine de fusion N-terminale (pEGFP-C1) ou C-terminale (pEGFP-N1) avec la protéine d’intérêt. Ces vecteurs pEGFP peuvent être utilisés pour étudier la localisation subcellulaire ou le trafic des protéines en suivant la fluorescence d’EGFP [38] [39].

Les vecteurs d’expression mammaliens les plus utilisés dans la revue de publications et dans les données provenant de la librairie wwPDB, conduisent l’expression de protéines de manière constitutive. Ceci malgré la disponibilité de systèmes d’expression mammalienne inductibles tels que les systèmes T-RexTM et pF12 RM FlexiTM.

Bien que peu représenté dans les publications académiques, le système BacMam est populaire dans l’industrie pharmaceutique pour l’expression de protéines pour des études en cellules ou la purification [40] [41] [42] et est maintenant disponible commercialement. Le système BacMam utilise un baculovirus modifie dans lequel le promoteur habituel est remplacé par le promoteur CMV actif en cellules mammaliennes. Le virus BacMam commande l’expression non réplicative et non lytique dans un grand nombre de type de cellules mammaliennes.

La Figure 4 présente deux procédés typiques d’expression de protéines. Un des procédés conduit à la génération d’une protéine purifiée. L’autre conduit à une lignée cellulaire exprimant une protéine recombinante. En réalité, ces deux procédés peuvent se chevaucher si, par exemple, une lignée cellulaire mammalienne stable est utilisée comme source dans la purification d’une protéine recombinante.

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Figure 4. Procédés d’expression de protéine typiques.