La technique de Westernblot, ou méthode d’immunotransfert, est utilisée pour mesurer les changements d’une protéine spécifique sous différentes conditions. La technique de Western Blot nécessite plusieurs étapes dont: la préparation des échantillons, le chargement des échantillons dans les puits du gel d’électrophorèse (gel d’acrylamide), l’électrophorèse, le transfert de protéines sur la membrane (nitrocellulose ou PVDF), l’incubation avec l’anticorps et la détection du signal. Pour pouvoir interpréter les résultats de n’importe quel Western Blot, un contrôle interne est nécessaire tout au long de ce procédé.

[agrandir]

Figure 1. Contrôles internes: A, Beta-actine. Cette image est adaptée de la Figure 1 in [1]. B, Tubuline. Cette image est adaptée de la Figure 1 in [2]. C, GAPDH. Cette image est adaptée de la Figure 2S in [3]. D, Lamine B. Cette image est adaptée de la Figure 1 in [2]. E, HSC70. Cette image est adaptée de la Figure 2 in [4]. F, Vinculine. Cette image est adaptée de la Figure 3 in [5].

Un contrôle interne permet de s’assurer que：

1. La même quantité de protéines est chargée dans chaque puits du gel d’électrophorèse,
2. Les protéines sont transférées du gel à la membrane avec la même efficacité pour chaque puits,
3. L’incubation avec l’anticorps (pour anticorps primaire, et si nécessaire, l’anticorps secondaire) et la détection du signal sont uniformes pour chaque puits,

Labome a revu 94 publications utilisant des contrôles internes pour Western Blot. Les résultats indiquent que l’actine (plus particulièrement beta-actine) est le contrôle le plus utilisé. La figure 1 présente une compilation d’images de Western Blot provenant de certaines de ces publications. D’autres observations intéressantes de cette revue sont discutées dans les paragraphes suivants.

Les protéines servant de contrôle interne doivent suivre certains critères. Ces critères sont :

1. le niveau de protéine des contrôles internes doit rester constant (en comparaison à la quantité de protéines totale) sous les conditions testées comme, par exemple, avec ou sans traitement avec certaine drogues ou au cours de différents états de développement,
2. le poids moléculaire des contrôles internes doit être différent de celui des protéines d’intérêt,
3. les limites de détection pour les contrôles internes et les protéines d’intérêt sont dans la même zone. C’est à dire que la méthode de détection et le protocole doivent permettre de détecter les changements de niveau des contrôles internes et des protéines d’intérêt sans saturation du signal.

Pour un Western blot spécifique, la zone de détection pour le contrôle interne peut être déterminée en développant un Western blot spécifiquement pour la protéine utilisée comme contrôle en utilisant une série de dilution et en examinant le signal. L’intensité du signal doit être proportionnelle à la dilution utilisée.

Différentes préparations d’échantillons nécessitent différent contrôles internes. La table 2 résume les contrôles internes communément utilisés pour: les protéines cytoplasmique et provenant de cellules intactes, les mitochondries, les protéines nucléaires, le tissu végétal et le sérum. Chacun de ces contrôles est discuté en détail ci-dessous.

Les actines appartiennent à une famille de six protéines divisée en trois groupes chez l’homme et les vertébrés: alpha( ACTC1, cardiac muscle 1), alpha 1 ( ACTA1, skeletal muscle) and 2 ( ACTA2, aortic smooth muscle), beta ( ACTB), gamma 1 ( ACTG1) and 2 ( ACTG2, enteric smooth muscle). Beta et gamma 1 sont deux actines non musculaires. Elles représentent le composant majeur des microfilaments. Les actines sont hautement conservées. L’actine beta d’espèces telles que l’humain, la souris et le poulet sont identiques. La beta actine-humaine présente environ 90% d’identité avec ses homologues fongiques. L’actine beta humaine est identique à environ 93% avec les autres membres de la famille des actines humaines. Une telle homologie entre les différents membres de la famille des actines et entre les espèces est importante dans la sélection de l’anticorps et l’interprétation des résultats en Western blot.

[agrandir]

Figure 2. Actines and microfilaments. L’image provient du NIH.

Les actines beta et alpha sont toutes les deux utilisées comme contrôle interne en Western blot. Veuillez lire la discussion détaillée sur l’actine beta et les clones communément utilisés comme contrôle interne ainsi que les questions fréquemment posées sur l’actine beta comme contrôles.

Les actines sont, en général, présentent dans les cellules en grandes quantités, il est donc important d’ajuster le volume d’échantillons chargés et le protocole du Western blot afin de pouvoir détecter les changements des niveaux d’actines.

La synthèse de l’actine est perturbée par des changements dans les conditions de croissance cellulaire. Publications indiquent que l’actine beta n’est peut-être pas un contrôle interne fiable pour les analyses de Western Blot [7]. L’actine beta est également présente dans le noyau comme composant des complexes de réagencement de la chromatine [8], cependant l’actine beta ne peut être utilisée comme contrôle interne pour les protéines nucléaires.

Glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH, G3PD, GAPD) catalyse la phosphorylation oxydative réversible du glyceraldehyde-3-phosphate en présence de phosphate inorganique et de nicotinamide adénine di nucléotide (NAD) pendant la glycolyse. GAPDH a aussi une activité nytrosylase et est impliqué dans la transcription génétique, le transport d’ARN, la réplication d’ADN et l’apoptose.

[agrandir]

Figure 3. Le tétramère de GAPDH est impliqué dans la glycolyse. L’image provient du NIH.

GAPDH est utilisé comme contrôle interne en Western blot et en PCR.

GAPDH est hautement conservé. Par exemple, GAPDH humain présente 335 acides aminés et partage environ 70% d’identité avec son homologue de 422 acides aminés chez Arabidopsis thaliana.

GAPDH est présent dans le cytosol, le noyau, les zones perinucléaires et membranes.

Une étude compréhensive indique que le taux d’ARNm de GAPDH varie de manière signifiante entre les différents types de tissus mais reste constant au regard de l’âge et du sexe [9].

L’hypoxie peut réguler l’expression de GAPDH [10, 11]. donc GAPDH ne peut être utilisé comme contrôle dans les études liées à l’oxygène.

Il est important de noter que GAPDH s’associe aux microfilaments (beta-actine) sous certaines conditions [12].

Il existe cinq types de tubulines : alpha, beta, gamma, delta, and epsilon. Hétéromères d’alpha- et beta-tubulines sont les éléments essentiels des microtubules.

[agrandir]

Figure 4. Tubulines en tant que composants structuraux des microtubules et les cibles pharmacologiques de différentes drogues. L’image provient du NIH.

Les sous-types de tubulines alpha comprennent 1a (TUBA1A), 1b (TUBA1B), 1c (TUBA1C), 3c (TUBA3C), 3d (TUBA3D), 3e (TUBA3E), 4a (TUBA4A), and 8 (TUBA8). Classes I (TUBB), IIa (TUBB2A), IIb (TUBB2B), III (TUBB3), IVa (TUBB4A), IVb (TUBB4B), V (TUBB6), VI (TUBB1), and VIII (TUBB8) représentent les sous-types detubulines beta.

Les tubulines gamma, gamma 1(TUBG1) and 2 (TUBG2), sont impliquées dans la nucléation et l’orientation polaire des microtubules, et elles sont présentes dans les centrosomes et les corps polaires des fuseaux. Delta (TUBD1) and epsilon (TUBE1) sont localisées au niveau des centrioles et sont les composants structuraux des fuseaux mitotiques.

Les tubulines sont conservées entre les espèces. Par exemple, la tubuline humaine alpha 1a avec 451 acides aminés présente 74% d’identité avec son homologue de levure Tub3p qui présente 445 acides aminés. Les sous-types d’alpha, beta, ou gamma sont également très similaire. Les tubulines alpha humaine partagent plus de 90% d’identité entre elles. Les différents types de tubulines sont également très homologues. Les tubulines alpha humaines partagent 40% d’identité avec les tubulines beta humaines Les tubulines alpha, beta, and gamma sont toutes utilisées comme contrôle interne.

Les tubulines sont les cibles pharmacologiques de plusieurs groupes de drogues, telles que les drogues anti-cancer Taxol, Tesetaxel, vinblastine, et vincristine, l’agent anti-goute colchicine, et les antifongiques griseofulvin. Ces drogues affectent l’expression des tubulines in vitro et in vivo.

Autre protéine du cytosquelette, vinculine, est aussi utilisée comme contrôle interne [13-16]. C’est un composant majeur des jonctions cellule-cellule et cellule-matrice. Chez l’humain, son poids moléculaire est de 117 kDa, vinculine possède 1066 acides aminés. Vinculine peut être utilisée comme contrôle interne pour les protéines de haut poids moléculaire Dans les tissus musculaires, un variant d’épissage présentant un exon additionnel de poids moléculaire de 150 KDa est aussi exprimé.

Les lamines sont des composants structuraux de la lamina nucléaire qui supporte l’enveloppe nucléaire et est impliquée dans la dégradation et reconstruction de l’enveloppe nucléaire pendant le cycle cellulaire. Dans les cellules animales, trois gènes encodent au moins 7 lamines. Le gène LMNA encode les types A et C de lamines via épissage alternatif, alors que les gènes, LMNB1 et LMNB2 encode les lamin B1 and B2. Les lamines de type B sont présentes dans chaque cellule. Les lamines de type A sont exprimées après la gastrulation et l’expression des lamines de type C est tissu spécifique.

[agrandir]

Figure 5. Enveloppe nucléaire et lamina. La figure provient de la référence [6].

Des modifications post-traductionnelles telles que la farnesylation et la phosphorylation se produisent sur les lamines et régulent la formation de la lamina nucléaire et l’activité des lamines. Parmi les lamines, la lamine B1 est souvent utilisée comme contrôle interne. La lamine B1 est conservée entre les espèces. La lamine B1 humaine partage 95% d’identité avec ses homologues chez les rongeurs, et 36% d’identité avec son homologue chez la mouche du vinaigre. La lamine B1 humaine présent plus de 50% d’identité avec les autres lamines humaines. La lamine B1 n’’est pas un contrôle interne approprié pour les échantillons sans enveloppe nucléaire.

La TATA-box binding protéine, TBP, est un facteur de transcription commun qui se lie spécifiquement à la séquence d’ADN, TATA avant la transcription de gène par l’ARN polymérase II. Les boites TATA sont présentes dans 10-20% des promoteurs humains. Le N-terminal de la TBP contient une longue chaine de glutamines (Gln, répétition de CAG dans les ARNm de TBP), qui module l’activité de liaison à l’ADN du C-terminal. Le nombre de Gln N-terminales varie chez les individus normaux (de 25 à 42 répétitions) et augmente jusqu’à 47-63 répétitions dans certaines conditions pathologiques. TBP est hautement conservée. TBP humaine présente environ 90% d’identité avec ses homologues chez les rongeurs et plus de 60-70% d’identité avec ses homologues fongiques.

Proliferating cell nuclear antigen, PCNA, est un cofacteur de l’ADN polymérase delta, et est exprimé dans le noyau cellulaire pendant la phase de synthèse d’ADN (phase S) du cycle cellulaire. PCNA est impliqué dans la réplication de l’ADN eucaryote. PCNA est conservé chez le chimpanzé, le chien, la vache, la souris, le rat, le poulet, le zebrafish, la mouche du vinaigre, le moustique, S. pombe, S. cerevisiae, K. lactis, E. gossypii, M. grisea, N. crassa, A. thaliana, et riz. PCNA humain présente 261 acides aminés et partage 97% d’identité avec ses homologues chez les rongeurs et 36% d’identité avec ses homologues fongiques. PCNA n’est pas un bon contrôle interne pour les cellules qui ne prolifèrent pas ou pour cellules subissant un traitement antiprolifératif.

La classe de porine VDCA1 (Voltage-dependent anion channels), représente la protéine majeure de la membrane externe mitochondriale dans les cellules eucaryotes. Il y a au moins trois membres chez les vertébrés (VDAC1, VDAC2 and VDAC3). VDAC1 est présente la membrane externe mitochondriale et la membrane plasmique, y servant des fonctions différentes. VDAC1 est exprimée dans le cœur, le foie et les tissus musculaires. Il existe de multiple variants du à l’épissage alternatif. Le gène VDAC1 est conservé chez le chimpanzé, le chien, la vache, la souris, le rat, le poulet, et le zebrafish. VDAC1 humain partage 99% d’identité avec son homologue murin et 85% d’identité avec le zebrafish.

Dans la membrane interne mitochondriale, cytochrome C oxydase est le dernier complexe enzymatique de la chaine mitochondriale de transport d’électrons. Le complexe comprend 13 sous-unités encodées par la mitochondrie et le noyau. La sous-unité VI du cytochrome C oxydase est communément utilisée comme contrôle interne. Il existe deux isoformes (1 et 2). Elles sont encodées par deux gènes nucléaires (COX4I1 and COX4I2). L’isoforme 1 est exprimée uniformément et l’isoforme 2 est fortement exprimée dans les tissus pulmonaires. Chez l’Homme, ces deux isoformes partagent 60% d’identité. L’isoforme I, COX4I1, est utilisée comme contrôle interne. COX4I1 humaine partage 80% d’identité avec son homologue murin, et est identique à 63% à son homologue chez le zebrafish.

La transferrine est une glycoprotéine du plasma sanguin dont la fonction principale est de transporter le fer du foie, des intestins et du système réticuloendothélial aux cellules prolifératives dans tout le corps. La transferrine humaine présente 698 acides aminés et est 73% identique à son orthologue murin et 43% identique à son orthologue chez le zebrafish. Son expression est affectée dans certains cas de maladies héréditaires et par les traitements à l’acide rétinoïque.

APX3, ascorbate peroxydase 3, est utilisée comme contrôle interne pour fraction membranaire végétale. C’est une peroxydase ascorbique microsomales qui récupère le peroxyde d’hydrogène des cellules végétales. Chez Arabidopsis, il existe trois isoformes cytosoliques (APX1, APX2, APX6), deux types chloroplastiques (stromal sAPX, thylakoid tAPX), et trois isoformes microsomales (APX3, APX4, APX5).

Plusieurs auteurs ont proposé de renoncer à l’utilisation d’une protéine comme contrôle interne et de se fier à la coloration des protéines avant (par du bleu de Coomassie [17] ) ou après (par coloration au Rouge Ponceau [18] ) l’étape de transfert. Une telle pratique ne prend cependant pas en compte les trois considérations majeures d’un contrôle interne idéal, l’uniformité du chargement des échantillons, le transfert de protéines et l’incubation avec l’anticorps/ détection du signal. La combinaison de ces trois procédés, un contrôle interne, coloration au Bleu de Coomassie du gel et coloration au Rouge Ponceau de la membrane de transfert représente un protocole de Western Blot bien conçu et doit donc être considéré.

Parmi les 94 publications revues par Labome, les anticorps provenant de différents fournisseurs ont été utilisés pour détecter différents type de contrôles internes.

Santa Cruz les anticorps polyclonaux fait chez la chèvre ont été utilisés pour étudier la signalisation de la dégradation de l’ADN dans la maladie “A-T like” et le syndrome de rupture de Nimègue [19], dans les chondrocytes articulaires [20]. Son anticorps anti-actine fait chez le lapin a été utilisé dans des expériences sur les cellules épithéliales rénales porcines LLC-PK1 [21]. Les anticorps anti- actine beta de Santa Cruz Biotechnology servent de contrôles internes pour les échantillons de cellules HUVEC [22], dans les extraits nucléaires de cardiomyocytes murins [23], dans les cellules rhabdomyosarcoma murines et les cellules RMS772 [24], dans les extraits cellulaires [25], dans les lymphocytes B mutés ou normaux [26], dans les cellules 293T [27], et dans les cellules épithéliales pigmentées de la rétine [28].

Les anticorps anti-actine de EMD Millipore/Chemicon sont utilisés dans les échantillons de lysats cellulaires préparés à partir de souris DAT-KO avec LiCl, injection du diluant ou alpha MPT [29], les lysats de cellules HT-29 et SK-OV-3 traitées avec les siRNA NMT1-1 ou NMT2-4 [30].

Les anticorps anti-actine d’ Abcam ont été utilisés pour étudier ABCA1 and ABCG1 dans les macrophages humains [31], et utilisés dans des études sur les cellules de carcinome rénal, 786-O, UOK121, and UMRC6 [32].

L’anticorps anti- actine b de Thermo Fisher Pierce / Neomarkers a été utilisé comme contrôle interne pour étudier le rôle de Brachyury dans la transition épithelio-mesenchymale dans les cellules tumorale et la progression tumorale [33].

Les anticorps anti-actine de Sigma ont été utilisés en Western Blot pour la détection de p53, WAF1, et MDM2 [34],dans les cellules HeLa, ES H2AX (H2AXflox/flox) sauvage, et ES H2AX-deficientes [35], dans une lignée cellulaire de lymphoïde B [36], deTRIM5 dans les singes rhésus [37], dans les cellules U937 [38], dans les fibroblastes et échantillons chirurgicaux de cerveau [39], dans les cellules de moelle osseuse murine [40], et dans les cellules T migrantes [41]. L’anticorps anti-actine alpha de chez Sigma a été utilisé en Western blots comme contrôle interne pour les cellules HeLa transfectées avec des RNAi contre PKD, Hsp27, ou vecteur contrôle [42]. Les anticorps anti-actine beta de chez Sigma ont été utilisés pour identifier des facteurs de transcriptions potentiellement important pour la différentiation neuronale mammalienne [43], dans les hépatocytes [44], dans les cellules endothéliales d’artère coronaire humaines [45], dans les cellules HeLa transfectées avec un siRNA Luc ou NudC [46], dans les cellules NCI-H460 et NCI-H1299 [47], dans la lignée cellulaire d’astrocytoma humain1321N1 [48], dans les cellules TAK1+/+ and TAK1-/- MEFs et HeLa S3 [49], dans le noyau et le cytoplasme de cellules HeLa [50], dans les cellules Jurkat sauvage et transfectées stablement avec Bcl-xL, Bcl-2 ou un vecteur control [51], dans les lymphocytes B spléniques de souris déficientes en p85-et les souris sauvages correspondantes [52], dans les cellules FN-/- adhérentes au collagène murines [53], et dans les cellules K562-R, LAMA-R, et leurs cellules parentales traitées avec 1 M d’imatinib mesylate [54].

Roche Molecular Biochemicals Les anticorps anti-actine (C4) de Roche Molecular Biochemicals ont été utilisés dans les références [55, 56].

Cytoskeleton L’anticorps anti-actine humaine fait chez la chèvre de Cytoskeleton a été utilisé en Western blots pour étudier l’effet des récepteurs nucléotidiques P2Y2 sur la transformation du précurseur de l’amyloïde dépendante de l’alpha-secrétase [57].

ICN Biomedicals L’anticorps monoclonal murin anti-actine d’ICN Biomedicals a été utilisé en Western blots pour des échantillons de cellules LN Cap et PC-3 [58].

Les tubulines alpha et beta ont toutes les deux été utilisées comme contrôles internes.

L’anticorps anti-tubuline alpha de Santa Cruz Biotechnology a été utilisé dans les cellules de fibroblastes humains GM00637 avec expression de MT-I/II ou MT-III [59] ou pour étudier le rôle de Che-1 dans l’activation de p21WAF1/Cip1 [60]. L’anticorps anti-tubuline beta de Santa Cruz Biotechnology a été utilisé dans les cellules 786-O [32] et K562 [61]. L’anticorps anti-tubuline (TU-02) de Santa Cruz a été utilisé en Western blots pour étudier la spécificité des anticorps contre RECQL4 [62].

Les anticorps anti-tubuline alpha de Sigma ont été utilisés comme contrôles internes dans les cellules Ln Cap et PC3M [63], pour étudier la down-régulation du gène de la polypose adénomateuse familiale par la voie ubiquitine-proteasome [64], dans les cellules COS exprimant la protéine MuSK [65], dans les cellules endothéliales vasculaires ombilicales humaines [66], dans les cellules T24 and HeLa [67]. L’anticorps monoclonal anti-tubuline beta a été utilisé dans la lignée cellulaire de carcinome du cou et de la tête A253 [68], dans les cultures de fibroblastes provenant de patients atteints d’atrophie musculaire spinale [69], et dans les cellules MCF-7, HCT116 p53+/+, RKO, M7TS90 p53 sauvage et p53-nulle [70]. L’anticorps monoclonal anti-tubuline de Sigma (clone DM1A) a été utilisé dans des échantillons de cerveaux embryonnaires et adultes [71], et dans les cellules NIH 3T3 transfectées transitoirement avec le vecteur contrôle, RACK1, ou le mutant RACK1 [72] L’anticorps anti-tubuline de BD PharMingen a été utilisé en Western blots d’échantillons de cellules HeLa Tet-on, cellules HeLa Tet-on-inductible FOXO4 stable (15-14), et les cellules BJAB ou RCC4 transfectées stablement avec un plasmide d’expression du VHL sauvage humain. [73]. L’anticorps anti-tubuline alpha d’Amersham Biosciences a été utilisé dans les cellules Jurkat [74] de même que l’anticorps monoclonal anti-tubuline d’Oncogene Science [75].

Les anticorps anti-GAPDH d’ EMD Millipore / Chemiconont été utilisés comme contrôle dans la référence [76], dans des homogénats de néocortex murins et de cellules N2a, ScN2a [77], de placenta humain [78], de cellules épithéliales isolées du parenchyme pulmonaire fœtal humain [79], et de lapin male blanc de Nouvelle Zélande après blessures au ballon [80].

L’anticorps monoclonal anti-GAPDH d’ Abcam a été utilisé en Western blot pour déterminer le niveau d’expression de GAPDH dans les cellules érythroides murines [81], et dans les cellules épithéliales pigmentées de la rétine [28].

L’anticorps anti-GAPDH de Santa Cruz Biotechnology a été utilisé comme contrôle interne pour étudier la régulation de la réponse cardiaque à un stress induit par une surcharge de pression par la voie de signalisation PDGFR-b des cardiomyocytes [82].

L’anticorps monoclonal murin anti-GAPDH d’ AbDSerotec a été utilisé en Western Blot sur 11 tissues de rat [83].

L’anticorps monoclonal contre la glyceraldehyde-3-phosphate déshydrogénase d’ HyTest(clone 6C5) a été utilisé en Western blot sur les progeniteurs de cellules CD34+ humaine, les cellules de moelle osseuse, et les cellules tumorales pour assurer un chargement des échantillons uniforme [84].

Les anticorps contre GAPDH de Sigma Aldrich [85], Biodesign International [86], et Covance [87] ont également été utilisés.

Les anticorps contre HSC70 de Santa Cruz Biotechnology HSC70 antibodies ont été utilisés comme contrôles internes pour les cellules hématopoïétiques en cours de différentiation [88], et pour les fibroblastes humains normaux GM38 [89]. L’anticorps anti-HSP70 de Stressgen Biotech anti-HSP70 antibody Western blot dans les cellules P388D1 [90]. Les anticorps polyclonaux anti-HSP90 de Santa Cruz Biotechnology polyclonal anti-HSP 90 antibodies ont été utilisés en Western blot comme contrôles internes cytosoliques de mastocytes humains [91] et dans les cellules humaines Hep3B et les cellules d‘hépatome FAO de rat [92].

L’anticorps de Santa Cruz Biotechnology antibody spécifique de PCNA (PC-10) a été utilisé en Western blots comme contrôle pour assurer un chargement des cellules humaines HEK293 uniforme [93]. L’anticorps monoclonal anti-proliferating cell nuclear antigen (PC10) de DAKO a été utilisé en Western blot comme contrôle interne des protéines de fibroblastes embryoniques murins [94].

L’anticorps anti-vinculine de Sigma a été utilisé en Western blot comme contrôle interne pour étudier la modulation du récepteur Œstrogènique alpha dans les cellules de cancer du sein [14], pour étudier l’interaction entre MTA1 etMAT1 [15], et dans les cellules NRK, CHO, et HeLa transfectées avec Cx43 [16].

Une variété d’autres protéines cibles ont été sélectionnées pour servir de contrôles internes dans plusieurs situations. L’anticorps anti-transferrine a été utilisé comme contrôle pour les échantillons de sérums [95]. La liste inclue APX3 [96], Arf1 [97], beta-caténine [1], calnexine [2], ERK-1 [20], ERK2 [3], HDAC1 [32], PDGFR alpha [91], facteur de transcription IID [4], le récepteur de la transferrine [5], lamine A/C [44], et la chaine lourde de myosine [4], LHCP [6], and Lhcb4 [98].