Le protéasome est la voie de dégradation majeure par laquelle les protéines mal conformées sont protéolysées. Le protéasome est présent dans toutes les cellules eucaryotes, les archées et certaines bactéries. C’est une protéase multi catalytique composée de multiples protéines catalytiques et régulatrices. Le protéasome possède trois ou quatre activités peptidases différentes, incluant une activité de type trypsine, une activité de type chymotrypsine et des activités d’hydrolyse peptidyl-glutamyl-peptide. Il y a deux types de protéasome que l’on peut distinguer par leur coefficient de sédimentation. Le protéasome 26S dépend de l’ATP et présent un poids moléculaire de 2,000 kDa. Le protéasome 20S est independent de l’ATP et présente un poids moléculaire d’environ 750 kDa. La plupart des protéines sont ubiquitinées avant dégradation par le protéasome.

Figure 1. Représentation schématique du système ubiquitine-protéasome. La figure provient du NIAAA, NIH.

Les inhibiteurs du protéasomes ont des applications thérapeutiques contre des maladies telles que le cancer, et de nombreuses applications en laboratoire de recherche. Bortezomib, aussi appelé PS-341, Velcade, et MG-341, est une drogue approuvée par la FDA pour le traitement de myélomes multiples et le lymphome à cellules du manteau. Il est aussi utilisé en laboratoire de recherche pour inhiber l’activité du protéasome [1]. Plusieurs autres inhibiteurs du protéasome incluant le Disulfiram, l’Epigallocatechin-3-gallate, le Salinosporamide A, le carfilzomib,l’ONX 0912, le CEP-18770, et le MLN9708, sont considérés comme drogues potentielles ou sont actuellement testés en essais cliniques.

Au 16 Octobre 2012, Labome avait revu 10096 articles sur les applications utilisant des anticorps. Parmi ces 10096 articles, Labome a revu les applications de tous les réactifs (incluant les anticorps) pour 2117 publications. Vingt-neuf des 2117 articles revus présentent des références aux inhibiteurs du protéasome. La table 1 résume le nombre de publications pour les inhibiteurs du protéasome majeurs. MG132 est l’inhibiteur de choix en laboratoire. Les caractéristiques principales des trois inhibiteurs du protéasome sont décrites dans la table 2.

MG132, aussi appelé carbobenzoxy-L-leucyl-L-leucyl-L-leucinal, Z-LLL-CHO, est un aldéhyde peptidique, un des groupes de produits chimiques capable d’inhiber différents types de protéases comme les serine protéases, la calpaine, etc. Il a été démontré que le MG132 et d’autres aldéhydes peptidiques inhibent fortement les activités peptidases multiples du protéasome ainsi que la calpaine [2].

Certaines des applications du MG132 provenant de la revue de la littérature par Labome sont présentées dans la Table 3 qui inclue également les références. Les publications indiquent une utilisation de MG132 à des concentrations de 1, 10, 25, 50 uM pour des périodes allant de 1 à plusieurs jours.

Le protéasome est une partie intégrante de la fonction cellulaire. MG132, comme tous les autres inhibiteurs du protéasome, est toxique pour les cellules et tissus, et induit la mort cellulaire à des concentrations élevées ou après des traitements prolongés. Il est donc essentiel de titrer la concentration optimale sur une large gamme (par exemple, 1000x). La concentration optimale dépend non seulement du type de cellules mais également des conditions de culture cellulaire comme la confluence des cellules, la concentration en sérum et la composition du milieu de culture.

MG132 doit être stocké à -20^oC, et peut être dissout dans du DMSO (10mg/ml) ou du méthanol (1 mg/ml), et aliquoté et stocké à -20 ou -80^oC. Lors de l’addition au milieu de culture, si la solution de MG132/DMSO produit un précipité, elle peut être réchauffée à 40^oC.

D’après les publications revues par Labome, plusieurs compagnies fournissent le MG132 EMD. Millipore (numéro de catalogue 474790) avec Calbiochem, EMD Biosciences, et Merck est un des fournisseurs majeurs de MG132.

Le MG132 de EMD Millipore / Merck / Calbiochem a été utilisé pour étudier les rôles des MAPKs (mitogen-activated protein kinases) et NFkappaB dans les monocytes humains [12], l’interaction entre les jonctions adhérentes dépendante de la cadhérine et la voie de signalisation Wnt [4], le mécanisme d’action de A20 dans l’inhibition de la signalisation de NF-kappaB [13], l’association du canal aqueux AQP1 avec les dépôts d’amyloïde-beta dans des cerveaux atteint de la maladie d’Alzheimer [14], la voie de signalisation de la BMP dans le cancer du colon [15], la voie de dégradation de IkappaBalpha [16], la régulation de la stabilité de DNMT1 dans les cellules mammaliennes [5], les rôles de RanBP2 et SENP3 dans la régulation de la SUMOylation de la Borealine [17], et dans l’auto-ubiquitination de cIAP1 induite par des antagonistes [3].

Le MG132 de Boston Biochem (maintenant R & D System) a été utilisé comme inhibiteur du protéasome pour traiter des cultures de cellules et étudier la régulation de l’expression de COMMD1 [18].

Le MG132 de BIOMOL (maintenant Enzo Life Sciences, numéro de catalogue BML-PI102-0005) a été utilisé pour étudier les rôles de l’ubiquitine-ligase dépendante du fer dans l’homéostasie du fer [9].

Le MG132 de Sigma a été utilisé dans plusieurs études [7, 8, 10, 19-23]. Le MG132 de Biovision [1], Peptide Institute [6], et VWR International [11] sont également cités.

Figure 2. Structure chimique du MG132.

La lactacystine est un antibiotique isolé de Streptomyces qui peut maintenant être synthétisé chimiquement. La lactacystine est hydrolysée dans les cellules et in vivo en clasto-lactacystine beta-lactone, qui est, probablement, l’inhibiteur actif qui modifie la thréonine N-terminale de la sous-unité X du protéasome mammalien 20S de manière covalente. La liaison covalente est hautement spécifique, de ce fait, elle n’affecte pas les cystéine et serine-protéases, se comportant de manière beaucoup plus spécifiques que les aldéhydes peptidiques comme le MG132.

Figure 3. Structure chimique de la lactacystine.

La lactacystine a été utilisée à 10 uM, 25 uM pour des heures en culture de cellules.

La lactacystine de EMD Millipore / Merck / Calbiochema été utilisée pour étudier les effets de la toxine œdème deBacillus anthracis sur la glycogène synthase kinase 3beta nucléaire [25] et pour étudier la régulation de l’ubiquitination et la dégradation de LRRK2 [26].

La clasto-lactacystine beta-lactone de BIOMOL (maintenant Enzo Life Sciences) a été utilisée pour étudier le rôle du domaine AF-1(activation function-1) dans la régulation de la mobilité nucléaire dépendent du protéasome du récepteur aux Œstrogène, ERbeta et dans le recrutement de l’ubiquitine-ligase associée à la protéine E6 [10].

La lactacystine de Bio-Connect [11] et de Sigma [19, 24] sont également citées.

Le proteasome inhibitor I de Calbiochem (PSI) a été utilisé pour incuber des cellules transfectées [27], et l’inhibiteur du proteasome I, PSI (N-carbobenzoxy-L-isoleucyl-L-gamma-t-butyl-L-glutamyl-L-alanyl-L-leucinal) de Peptide Institute a été utilisé pour traiter des cellules [28].

Velcade, (synonyme: PS-341, MG-341), a été utilisé pour inhiber l’activité du protéasome en laboratoire [1]. La toxicité cellulaire de Velcade a été étudiée. Le traitement de cellules HEK-293 avec 50 umol/L de Velcade pour 8 heures n’entraine pas de perte de cellules signifiante. Une incubation prolongée (24 heures) avec 0.5 to 50 μmol/L de Velcade entraine environ 40% de mort cellulaire [19].

L’ADP-ribosylation de PI31par ADP-ribosyltransferase tankyrase (TNKS) inhibe la répression de 20S par PI31 et donc promeut l’activité du protéasome 26S. XAV939, est un inhibiteur de TNKS, qui bloque l’ADP-ribosylation de PI31.

Un problème important lorsqu’on utilise des inhibiteurs du protéasome, est de s’assurer que l’activité du protéasome a effectivement été atténuée. Plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour vérifier l’inhibition. Une méthode simple consiste à utiliser le Suc-LLVY-AMC (N-succinyl-L-leucyl-L-leucyl-L-leucyl-7-amido-4-methylcoumarin), comme indicateur fluorescent de l’activité du protéasome [29]. Une autre méthode consiste à examiner le ratio des quantités de fragments de mono et poly-ubiquitine par western blot. Le taux de mono-ubiquitine devrait être plus faible si l’activité du protéasome est inhibée.