Les protéines purifiées sont nécessaires pour de nombreuses applications expérimentales, y compris des études structurelles et des dosages biochimiques in vitro. Les protéines peuvent être obtenues à partir de tissus ou, plus souvent, par leur surexpression dans un organisme modèle, comme des bactéries, des levures ou des cellules de mammifères en culture. La purification des protéines consiste à isoler des protéines, sur la base de différences dans leurs propriétés physiques. L'objectif d'un système de purification des protéines est de conserver la plus grande quantité de protéines fonctionnelles avec moins de contaminants possible. Le système de purification d'une protéine doit être optimisé pour achever ce processus dans le plus petit nombre d'étapes.

Figure 1. La solution tampon Tris contient du Tris base et ses conjugués acides. Le pK_a du Tris à 25°C est 8.06, indiquant qu’à pH = 8.06, 50% du Tris est protoné (dans sa forme acide) et 50% est déprotoné (dans sa forme basique).

L'article passe en revue quatre types de chromatographie sur colonne qui sont couramment utilisés dans la purification des protéines, et discute les avantages, les inconvénients et les problèmes potentiels de chacun. Cet article rapporte également une revue de Labome sur 98 publications. La revue indique que la chromatographie sur colonne d'affinité, surtout basée sur les tags HIS, GST, et FLAG tags, et la chromatographie d'exclusion stérique sont les principales méthodes citées dans les publications. GE Healthcare est le principal fournisseur de réactifs et d'instruments utilisés dans la purification des protéines.

Le facteur le plus important dans le développement d'un système de purification des protéines est l'application en aval de la protéine purifiée. La quantité et la pureté de la protéine doit être suffisante pour l'analyse expérimentale. De plus, des informations sur le comportement de la protéine doivent être prises en considération, comme une protéine dons sa conformation native et fonctionnelle est nécessaire pour les études en aval. Pendant la purification et le stockage ultérieur, de nombreux processus peuvent se produire qui affectent la qualité des protéines: la dérnaturation des protéines, l'agrégation, la dégradation et la perte de fonction. Une planification minutieuse pour purifier une protéine aussi rapidement que possible et dans les conditions les plus stables permettra de maximiser les chances d'un système de purification efficace.

Figure 2. Un système Äktaprime plus system pour la séparation chromatographique de protéines automatisée. (DeGE)

Les conditions de la solution d'une protéine à chaque étape du schéma de purification sont essentielles dans le maintien de la stabilité et de la fonction des protéines. Les protéines doivent être conservées dans un environnement bien tamponné pour éviter les changements brusques de pH qui pourraient affecter de manière irréversible leur repliement, leur solubilité, et leur fonction.

Un tampon est une solution contenant une paire d'acide / base conjugués. La gamme de pH d'un tampon repose sur so pK_a, défini comme le pH à laquelle 50% des molécules sont sous leur forme acide, et 50% sont sous leur forme basique (figure 1). Une règle générale en ce qui concerne les tampons est que le pH de la solution tampon devrait être dans 1,0 unité de pH du pK_a de manière à fournir une capacité tampon appropriée. Ceci garantit qu'il existe une quantité suffisante de la molécule sous ses deux formes acide et basique pour neutraliser la solution dans le cas d’un afflux de H⁺ ou OH^- Ainsi, les tampons empêchent les changements de pH qui pourraient affecter négativement la stabilité des protéines.

Figure 3. Ligand Ni-NTA fixé de manière covalente à une matrice d'agarose réticulé pour la purification sélective des protéines poly-histidine-tag. Les résidus d'histidine peuvent se lier sur Ni²⁺ en remplaçant les molécules d'eau liées (indiqué par les flèches rouges). L’imidazole ou des histidines libre peuvent ensuite être utilisés pour éluer la protéine, par leur capacité à se lier avec l'ion Ni²⁺ et déplacer la protéine liée. De BioKe.

Un bon tampon doit présenter les caractéristiques suivantes [1] :

1. Solubilité dans l'eau
2. Stabilité chimique
3. Grande capacité tampon au pH désiré
4. Compatibilité avec les applications analytiques et expérimentales
5. Compatibilité avec les autres composants de la solution

De nombreux éléments peuvent servir de tampons biologiques. Comme les tampons peuvent être utilisés à un pH physiologique, les composants de tampon les plus couramment utilisés ont un pK_a, proche de la neutralité. Quatre des tampons biologiques les plus courants sont énumérés dans la table 1, ainsi que la gamme de pH à laquelle ils peuvent être utilisés, et les avantages et les inconvénients qui pourraient influer sur leur utilisation dans la purification des protéines. En règle générale, ces tampons sont utilisés à des concentrations supérieures à 25mm pour assurer la capacité de tampon adéquate.

En plus d'un système tampon approprié, les solutions utilisées au cours de purification de protéines, de la lyse de stockage, contiennent souvent de nombreux autres composants qui jouent un rôle dans la facilitation de la pureté, de la stabilité et de la fonction de la protéine.

Les inhibiteurs de protéase sont souvent ajoutés au tampon de lyse et dans les premières étapes du procédé de purification visant à prévenir la dégradation de la protéine cible par des protéases endogènes. Ceux-ci ne sont généralement pas nécessaires dans les stades ultérieurs de la purification, comme la plupart ou la totalité des protéases contaminantes ont été séparées de la protéine d'intérêt. Les réactifs chélateurs de métaux tels que l'EDTA ou l'EGTA, sont souvent ajoutés au tampon de stockage. Ces chélateurs de métaux se lient Mg²⁺ et, ainsi, empêchent le clivage de la protéine purifiée par des métalloprotéases contaminantes. D'autres additifs sont souvent utilisés pour protéger les protéines contre les dommages et d'améliorer leur solubilité.

Les additifs ne doivent être utilisés que si nécessaire. Les étapes d’essais et d’erreurs sont souvent nécessaires pour déterminer les additifs spécifiques qui sont bénéfiques à la purification d’une protéine particulière.

D'autres facteurs contribuent également à la stabilité de la protéine lors de la purification. Le moins de manipulation possible lors de la purification d’une protéine est toujours la meilleure approche. La conception d'une méthode de purification qui utilise le nombre minimum d'étapes dans un laps de temps court assure le plus haut rendement de protéines fonctionnelles. De plus, il est souvent préférable de garder la protéine à froid tout au long de la purification. Typiquement, la purification est effectuée à 4°C, car cette température inférieure ralentit la vitesse de protéolyse (en cas de contamination de protéases) et favorise l'intégrité structurale des protéines.

Le principe de la chromatographie sur colonne est de séparer un pool de protéines en de nombreux petits pools, dont certains sont enrichis avec la protéine d'intérêt. Bien que l'équipement coûteux et spécialisé soit disponible pour chromatographie sur colonne, seul l'équipement de base est nécessaire.

Figure 4. Schéma de purification d'affinité utilisant la protéine A, G, ou L. A. Les anticorps contiennent plusieurs régions d'intérêt: Fc (fragment constant) qui est le même pour toutes les protéines de la même classe, Fv (fragment variable) qui offre une spécificité pour chaque anticorps, et Fab (fragment de liaison de l'antigène) qui entre en contact avec l'antigène spécifique. B. les catégories spécifiques d'anticorps peuvent être purifiées de manière non sélective par purification par affinité, dans laquelle le ligand (protéine A, G ou L) est conjugué à une matrice. C. Les protéines A, G ou L peuvent également être utilisées pour purifier des protéines spécifiques. Dans ce cas, l'anticorps sera un ligand intermédiaire assurant une sélectivité pour son antigène.

L'équipement de base pour la chromatographie sur colonne:

1. Phase stationnaire - une matrice inerte, souvent avec un groupe fonctionnel attaché pour faciliter l'interaction de la protéine, qui sert à séparer les protéines. Le choix de la phase stationnaire et le groupe fonctionnel dépend à la fois du type de chromatographie qui est en cours d'exécution et le procédé par lequel elle sera réalisée.
2. Colonne -un réservoir cylindrique en verre disponible en différentes longueurs et diamètres. Les colonnes peuvent être achetées pré-remplies avec une phase stationnaire et prêtes à être attachées aux systèmes automatisés de chromatographie (discuté dans la partie 2 de cette section) ou peuvent être achetées vide pour le remplissage manuel. Différents types de colonnes sont nécessaires pour la chromatographie automatisée par rapport à la chromatographie de flux par gravité.
3. Solvants - des tampons contenant des additifs utilisés pour l'équilibrage, le lavage, et l’élution de protéines de la phase stationnaire. Différents types de chromatographie nécessitent des conditions différentes de solvant.
4. Tubes de prélèvement – Tubes utilisés pour recueillir les échantillons d'élution. Des tubes spéciaux sont nécessaires pour les collecteurs de fractions automatisés, mais n'importe quel tube est approprié pour la collecte de fractions manuelle.
5. Test pour mesurer la pureté - une approche pour déterminer la quantité relative d'une protéine spécifique par rapport aux protéines totales dans un échantillon. Les fractions contenant la protéine d'intérêt doivent être déterminées après chaque étape avant de passer à la prochaine étape dans la méthode de purification. Certaines méthodes courantes d'analyse de pureté seront examinées dans une section ultérieure.

La chromatographie sur colonne peut être réalisée avec des systèmes automatisés (figure 2), qui utilisent une pompe pour forcer le solvant sur une colonne remplie de matrice à un débit consigne constant, ou peut être exécutée par gravité. Les deux systèmes, automatique et par gravité peuvent être couplés à des systèmes de collecte de fractions automatiques. Il y a des avantages et des inconvénients pour chaque système. Le système de GE Healthcare, FPLC AKTA, est un choix très commun [5] [6] [7] [8].

Les quatre principaux types de chromatographie sur colonne comprennent la chromatographie d'affinité, la chromatographie échangeuse d'ions (IEX), la chromatographie d'interaction hydrophobe (HIC), et la chromatographie d'exclusion de taille (SEC). La plupart des systèmes de purification nécessitent l'utilisation de plusieurs de ces types de procédures chromatographiques pour obtenir la pureté nécessaire pour les applications en aval. Le choix de la (les) méthode(s) chromatographique(s) la (les) plus appropriée(s) et l'ordre de ces méthodes est essentielle dans l'optimisation d'une méthode de purification des protéines.

En analysant la séquence d'une protéine, des caractéristiques uniques peuvent être identifiées qui peuvent aider à sa purification. La taille et la charge d'une protéine (à un pH spécifique) peut être déterminée, ainsi que l'identification de grandes régions de résidus hydrophobes.

La chromatographie d'affinité repose sur la fixation spécifique et réversible d'une protéine à un ligand lié à la matrice. Le ligand peut soit se lier directement à la protéine d'intérêt ou à un tag qui est attaché de manière covalente à la protéine. La chromatographie d'affinité est souvent la procédure de purification la plus robuste et est généralement utilisée dans les premiers stades de la méthode de purification. En fonction de l’application en aval, la purification par affinité peut être la seule étape de chromatographie nécessaire pour atteindre une pureté adéquate.

Figure 5. La charge nette sur une protéine est influencée par le pH de son solvant. A pH = pI, la protéine a une charge nette de zéro et, par conséquent, ne se lie pas à une phase stationnaire d'échange de cations ou d'anions. L'ajustement du pH au-dessus ou en dessous du pI de la protéine va conduire à une charge nette, et à la liaison de la protéine soit à une phase stationnaire d’échange d'anions (pH > pI) ou de cations (pH < pI).

La phase stationnaire pour la chromatographie d'affinité est réalisée sur une matrice inerte fixée de manière covalente à un ligand qui se lie spécifiquement à une protéine ou un groupe de protéines. La matrice inerte est généralement composée d'agarose réticulé ou de polyacrylamide. Les protéines peuvent être purifiées par chromatographie d'affinité d'une manière sélective ou non sélective. Dans la chromatographie d'affinité sélective, un ligand spécifique d'une protéine ou d'un tag lié de manière covalente est utilisé. Dans la chromatographie d'affinité non sélective comme la protéine A, G, L pour les immunoglobulines, ou de l'héparine pour des protéines liant l'ADN, ou la lectine pour les glycoprotéines, le ligand se lie à un groupe de protéines avec des capacités de liaison similaires.

Dans les deux types de chromatographie d'affinité, les protéines sont chargées sur la colonne dans des conditions qui influencent la liaison entre la protéine (ou tag) et son ligand. La protéine liée est lavée dans des conditions qui ne perturbent pas l'interaction spécifique, mais qui peut perturber les interactions non spécifiques entre protéines contaminantes et la phase stationnaire. La protéine liée est ensuite éluée avec un tampon contenant une molécule concurrente ou des conditions qui perturbent les interactions protéine / protéine. Les molécules concurrentes se lient au ligand, déplaçant la protéine d'intérêt. Cette molécule concurrente est généralement éliminée de la protéine d'intérêt, soit par un autre procédé chromatographique ou une dialyse. Les méthodes d’élution des protéines à partir de la phase stationnaire en perturbant les interactions protéine / protéine incluent ajuster le pH ou la force ionique du tampon. Ces méthodes peuvent affecter la stabilité de la protéine, et il est suggéré de neutraliser ou de diluer la protéine éluée immédiatement pour minimiser les dommages. Pour certaines formes de chromatographie d'affinité, des conditions d'élution alternatives ont été décrites afin de maximiser le rendement de protéines fonctionnelle [11] [12].

Dans la conception d'un plasmide pour l'expression des protéines, des tags d'affinité peuvent être insérés sur l'extrémité N-ou C-terminale (ou dans certains cas rares, dans des boucles flexibles de protéines ayant des structures connues) pour aider à la purification. Voir l’article de Labome sur les tags protéiques et peptidiques pour une liste de tags communs et une discussion de chacun.

Les anticorps sont purifiés souvent sur la base de l'interaction très spécifique qui se produit entre un anticorps et son antigène (la séquence reconnue par l'anticorps). Un peptide contenant l'antigène peut être couplé à une matrice pour une liaison spécifique de l'anticorps. L'abaissement du pH du tampon d'élution perturbe l'interaction anticorps / peptide pour libérer l'anticorps lié. Cette méthode est souvent utilisée dans le commerce pour l'isolement d'anticorps à partir du sérum brut.

Figure 6. Chromatographie par échange d'ions. Les protéines sont liées à une phase stationnaire chargée à faible force ionique. Les protéines fixées sont éluées en augmentant la force ionique du tampon ou par l'ajustement du pH.

Les protéines peuvent également être purifiées par affinité d'une manière non-sélective. Dans la purification non-sélective, le ligand fixé à la phase stationnaire se lie à un groupe de protéines avec des partenaires de liaison similaires. Un exemple de purification par affinité non sélective est la purification des protéines liant l'ADN. L’héparine imite l'ADN à la fois dans sa structure et sa charge, et peut être utilisée en tant que ligand pour la purification par affinité des protéines liant l'ADN. Alors que toutes les protéines liant l'ADN peuvent théoriquement se lier à cette phase stationnaire, la plupart des autres protéines ne le font pas et sont éliminées, conduisant à un enrichissement suffisant de la protéine d'intérêt. Un autre exemple est l'enrichissement des anticorps par la liaison de leur région constante (Fc) au ligand, la protéine A, G ou L. Les colonnes d'affinité protéine A de GE Healthcare sont un choix commun [13] [14] [15], comme l’est la protéine G [16].

L'utilisation d'un même mode de liaison (un anticorps lié à une protéine ligand A, G, ou L), la région de liaison à l'antigène (Fab) de l'anticorps est encore disponible pour la liaison à son antigène spécifique. Ainsi, certaines protéines peuvent être purifiées sur la base de l'interaction spécifique entre le ligand / anticorps couplé et l'antigène de l'anticorps.

Problèmes courants et solutions sont listés dans le Tableau 6.

La chromatographie par échange d'ions (IEX) sépare les protéines en fonction de leur charge de surface nette, grâce à des interactions électrostatiques qui se produisent entre les protéines et une phase stationnaire chargée. Deux types d’IEX existent: (1) échangeuse d'anions (phase stationnaire chargée positivement qui se lie à des protéines chargées négativement) et (2) échangeuse de cations (phase stationnaire chargée négativement qui se lie à des protéines chargées positivement). La chromatographie échangeuse d'ions est couramment utilisée comme une étape intermédiaire dans une méthode de purification des protéines, mais elle peut donner une résolution élevée pour certaines protéines lorsqu'elle est utilisée plus tôt ou plus tard au cours de la purification.

Toutes les protéines présentent une charge nette qui dépend de la composition en acides aminés de la protéine ainsi que des modifications attachées de manière covalente. La charge nette d'une protéine est influencée par le pH du solvant dans lequel elle est dissoute, comme le solvant échange des ions d'hydrogène avec les protéines. Le point isoélectrique (pI) d'une protéine est le pH auquel la protéine n'a pas de charge nette. A un pH supérieur au pI, une protéine aura une charge nette négative, tandis qu'un pH inférieur au pI mènera à une charge nette positive. Ainsi, le pH du solvant peut être ajusté afin de faciliter la liaison à l’IEX ou de promouvoir l'élution d'une protéine liée.

Figure 7. Chromatographie d'interaction hydrophobe. A force ionique élevée, les protéines sont partiellement dénaturée, les obligeant à adopter des conformations alternatives dans lesquelles les résidus hydrophobes normalement enfouis sont plus exposés. Ces résidus peuvent alors former des interactions hydrophobes avec les groupes fonctionnels hydrophobes conjugués à une matrice. L'abaissement de la force ionique entraîne le repliement de la protéine dans sa conformation native, cachant ses résidus hydrophobes. Cela diminue les interactions hydrophobes entre la protéine et la phase stationnaire, ce qui facilite l'élution de la protéine.

Théoriquement, toutes les protéines peuvent se lier à la fois aux matrices d'échange de cations et d'échange d'anions, si le pH du tampon est ajusté en conséquence. Toutefois, pour la purification de protéines, la stabilité de la protéine est le facteur le plus important dans le choix de conditions de purification et, par conséquent, la colonne la plus appropriée pour la liaison de la protéine. Par conséquent, il est nécessaire de déterminer si les conditions nécessaires pour la liaison à une des formes de chromatographie échangeuse d'ions affectent la stabilité et la fonction des protéines. Typiquement, les conditions de liaison à un type d'échangeur d'ions sont plus appropriées pour une protéine particulière que l'autre.

La connaissance du point isoélectrique d'une protéine peut aider à déterminer le type le plus approprié de chromatographie échangeuse d'ions. Les outils en ligne sont disponibles pour calculer le pI théorique d'une protéin EXPASY. Ces calculs sont basés entièrement sur la séquence d'acides aminés d'une protéine et ne prennent pas en compte la structure tridimensionnelle de la protéine. Dans son état naturel, des résidus d'une protéine sont plus exposés que d'autres et, par conséquent, le pI réel et la charge de surface nette sont parfois différents de ceux déterminés théoriquement [17]. La distribution des acides aminés les uns par rapport aux autres peut aussi affecter le pI d'une protéine [18], et cela n'est pas pris en considération avec les calculs théoriques de pI. Certaines techniques permettent la détermination expérimentale du pI d'une protéine à l'état natif, comme l’isoélectrofocalisation électrophorétiques [19], l’isoélectrofocalisation capillaire [20], et une approche à haut débit basée sur la luminescence plus récente [21].

En règle générale, la liaison d'une protéine à l’IEX doit être déterminée par essais et erreurs, en utilisant des solvants avec une gamme de valeurs de pH pour déterminer le pH optimal pour la rétention des protéines. Un pH de solvant qui est d'environ une unité de pH loin du pI est généralement suffisant pour la liaison de protéine [22] ; mais, dans certains cas, un pH plus éloigné du pI est nécessaire [23].

La phase stationnaire de IEX est composée d'une matrice d'agarose à base de polymère inerte ou avec un groupe chargé lié de façon covalente. Les particules de matrice sont disponibles en plusieurs tailles, et peuvent être non poreuses ou peuvent contenir des pores de taille variable. Le choix de la matrice dépend de la capacité de liaison désirée, la résolution et la vitesse d'écoulement. Les tailles de particules plus petites offrent une résolution plus élevée, mais nécessitent des débits plus faibles et prennent plus de temps. Les matrices poreuses offrent une capacité de liaison supérieure aux matrices non poreuses. Dans une matrice non-poreuse, les protéines ne peuvent pas entrer dans la résine et, par conséquent, ce type de matrice offre une meilleure récupération de l'échantillon, une meilleure résolution et des temps d'exécution plus courts que les matrices poreuses. Une étude a montré que, pour la plupart des protéines, la résolution et la récupération sont similaires quand elles sont séparées par une matrice poreuse ou non-poreuse, mais pour des protéines de grande taille, les matrices poreuses provoquent une perte de résolution basée sur les effets d'exclusion de taille [24].

Figure 8. Protéine éluée d'une colonne d'interaction hydrophobe avec un gradient de sel (sulfate d'ammonium) décroissant. Les fractions ont été analysées à la fois pour la teneur en protéine totale et l'activité spécifique de la protéine d'intérêt. Le pic centré à la fraction 45 contient la protéine d'intérêt, comme indiqué par l'activité protéique. A partir de http://www.insectscience.org/9.04/.

Les quatre groupes fonctionnels chargés les plus couramment utilisés dans l’IEX sont indiqués ci-dessous. Ceux-ci sont classés comme échangeurs fort ou faible, avec des échangeurs forts étant ionisés dans une gamme de pH plus large que les échangeurs faibles.

Échange d'anions (phase stationnaire chargée positivement) :

1. ammonium quaternaire (Q) - échangeur d'anions fort
2. diéthylaminoéthyle (DEAE) - échangeur d'anions faible

L'échange de cations (phase stationnaire chargée négativement) :

1. méthyl sulfonate de (S) - échangeur de cations fort
2. carboxyméthyl (CM), - échangeur de cations faible

Les échangeurs forts doivent être utilisés lorsque le pH requis pour la liaison est très acide ou basique (en supposant que ce pH soit également approprié pour maintenir la stabilité des protéines), comme les groupes fonctionnels restent chargés sur une gamme de pH plus large [25]. Les échangeurs faibles fournissent moins de rétention pour certaines protéines, ce qui permet leur élution à une force ionique plus faible [26]. Parce que la force ionique élevée peut affecter la stabilité de certaines protéines [27], les échangeurs faibles pourraient être plus appropriés pour des protéines qui ne nécessitent pas un pH extrême pour la liaison.

Dans la chromatographie d'échange d'ions, la phase stationnaire est d’abord équilibrée avec un tampon de faible force ionique. L'échantillon de protéines est ensuite chargé sur la phase stationnaire dans le même tampon de faible force ionique utilisé pour l'équilibrage de la colonne. La protéine liée est lavée abondamment avant l'élution avec un tampon de force ionique plus élevée ou, dans certains cas, un tampon avec un pH modifié (figure 6). Les contre-ions dans le tampon d'élution interagissent avec la phase stationnaire chargée, en déplaçant la protéine liée. Certains sels sont plus efficaces pour une utilisation en chromatographie échangeuse d'ions que d'autres, en raison de leur aptitude à déplacer protéines liées et leurs effets sur la stabilité des protéines [28]. En général NaCl ou KCl sont utilisés pour l'élution, avec les ions Na⁺ ou K⁺ qui servent de contre-cations dans la chromatographie d'échange de cations et Cl - servant de contre-anion dans la chromatographie d'échange d'anions. Alternativement, le pH du tampon peut être modifié pour réduire la charge des protéines et perturber son interaction avec la phase stationnaire. Pour les protéines liées à une phase stationnaire d'échange de cations, l'augmentation du pH du tampon conduira à une charge positive moindre sur la protéine, et à l'élution de la colonne. Pour les protéines liées à une phase stationnaire d'échange d'anions, la diminution du pH du tampon conduira à une charge négative moindre sur la protéine, et à l'élution de la colonne.

Figure 9. Un mélange de trois protéines de rayon hydrodynamique variable est chargé sur une colonne d'exclusion de taille. Les grosses protéines sont éluées en premier, car elles sont incapables de pénétrer dans les pores de la matrice et passe facilement à travers la colonne. Les petites protéines peuvent pénétrer dans les pores, et passe plus lentement à travers la colonne.

Alternativement, le pH du tampon peut être ajusté de telle sorte que la protéine d'intérêt ne se lie pas à la phase stationnaire d'échange d'ions tandis que les protéines contaminantes le font. Dans ce cas, la protéine d'intérêt est recueillie dans la phase d’écoulement de la colonne, alors que certaines protéines contaminantes sont éliminées par leur liaison à la phase stationnaire.

Comme avec d'autres méthodes chromatographiques, la chromatographie par échange d'ions peut présenter des problèmes lors de la détermination des conditions optimales pour la liaison aux protéines, l'élution de la protéine, et une résolution adéquate.

La chromatographie d'interaction hydrophobe (HIC) sépare les protéines en fonction de leur caractère hydrophobe, et est souvent utilisé comme une étape intermédiaire dans un système de purification. Les protéines sont liées à une phase stationnaire dans un tampon de force ionique élevée et, par conséquent, HIC peut typiquement être réalisée immédiatement après la chromatographie par échange d'ions, sans échange de tampon ou de dilution nécessaire. HIC est aussi couramment réalisée après une précipitation au sulfate d'ammonium, une procédure qui peut être utilisée pour éliminer rapidement les protéines par précipitation de certaines, mais pas la totalité, des protéines avec du sel. HIC est parfois applicable dans les premières étapes d'un procédé de purification ou en tant qu'étape finale de l'élimination des traces d’impuretés de la protéine d'intérêt.

La présence d'ions de sel en solution peut conduire à la dénaturation partielle d'une protéine et à l'exposition des résidus hydrophobes normalement enfouis. Les protéines qui se lient à la phase stationnaire adoptent leur conformation native lorsqu’un tampon avec une force ionique plus faible est ajouté. Cela diminue l'exposition des résidus hydrophobes qui peuvent interagir avec la phase stationnaire, et facilite l'élution de la colonne. Pour les protéines qui peuvent se replier spontanément par une diminution de la force ionique, HIC peut être une méthode chromatographique précieuse pour la purification.

En règle générale, la force ionique du tampon de liaison doit être aussi faible que possible pour lier la protéine d'intérêt, tout en empêchant sa précipitation. Si la force ionique nécessaire pour la liaison aux protéines est élevée et provoque la précipitation de la protéine d'intérêt, une force ionique plus faible peut être utilisée. Dans ce cas, la procédure de chromatographie peut être utilisée pour séparer la totalité des protéines de liaison de la protéine d'intérêt qui, elle, n’est pas retenue sur la colonne et est éluée dans les premières étapes de la purification.

Avant de charger l'échantillon sur la colonne, la phase stationnaire doit être équilibrée avec le tampon de force ionique élevée (le même tampon dans lequel l'échantillon de protéine sera charge sur la colonne). L'échantillon est ensuite chargé sur la colonne, la colonne est lavée intensivement, et la protéine est éluée avec un tampon de force ionique faible (figures 7 et 8).

La phase stationnaire utilisée pour la chromatographie d'interaction hydrophobe est composée d'une matrice de base faite d’agarose réticulé ou d’un copolymère synthétique. Un ligand alkyle ou aryle est ensuite conjugué à la matrice de base, fournissant une spécificité pour des molécules hydrophobes.

Types de groupe fonctionnel:

1. Alkyle - une chaîne hydrocarbonée de différentes longueurs; souvent un groupe butyle ou octyle est utilisé. La capacité de liaison de la phase stationnaire est augmentée avec l'augmentation de longueur de chaîne alkyle [29]. Les groupes fonctionnels lient des protéines entièrement sur l’hydrophobicité de la protéine
2. Aryle - un groupe fonctionnel dérivé d'un cycle aromatique; souvent un groupe phényle. Les groupes aryle offrent spécificité croissante, les protéines peuvent également interagir avec le groupe fonctionnel grâce à des interactions d'empilement de base.

Le type et la concentration de sel utilisés pour la liaison et l'élution doivent être déterminés empiriquement pour chaque protéine. De plus, le repliement et la fonction de la protéine doit être assurée après son élution.

Comme d'autres formes de chromatographie sur colonne, une procédure HIC optimale peut nécessiter beaucoup de d’ajustement. L’ajustement des conditions de tampon et de la phase stationnaire sont nécessaires pour chaque protéine pour assurer une séparation optimale.

La chromatographie d'exclusion de taille sépare les protéines par leur rayon hydrodynamique, une propriété déterminée à la fois par la taille et la forme de la molécule. Contrairement aux autres méthodes chromatographiques décrites précédemment, les protéines ne se lient pas à une phase stationnaire en SEC. Au lieu de cela, les protéines sont séparées par la vitesse à laquelle elles naviguent à travers une phase stationnaire inerte (Figure 9).

La SEC est une méthode valable le plus souvent utilisée dans les étapes finales d'un système de purification en raison de sa capacité à différencier les différentes espèces d'une protéine. Les espèces oligomérique [30], les protéines dépliées [31], et tronquées [32] peuvent toutes être séparées de la protéine native, tout en échangeant simultanément des composants du tampon. Souvent, SEC est utilisée comme une méthode d'échange de tampon plus rapide et plus fiable que la dialyse, car elle est compatible avec plusieurs solvants et nécessite moins de tampon. Un seul solvant est utilisé tout au long de la procédure SEC, et les phases stationnaires SEC disponibles sur le marché sont compatibles avec les tampons les plus couramment utilisés.

Le type de la phase stationnaire utilisée et la longueur de la colonne jouent un rôle critique dans la résolution de protéines séparées par SEC. Plusieurs types de phases stationnaires sont disponibles dans le commerce, et la meilleure option dépend de la masse moléculaire des protéines qui nécessitent une séparation et les conditions dans lesquelles la séparation sera effectuée.

Superdex est souvent le meilleur choix pour les procédures SEC typiques, car il est compatible avec la plupart des solvants et offre la résolution la plus élevée de toutes les phases stationnaires disponibles.

Comme avec d'autres méthodes chromatographiques, il y a des avantages et des inconvénients à la SEC, et la décision d'utiliser cette méthode dépend à la fois de la protéine et de son application en aval.

Avantages de la SEC:

1. Permet l’échange de tampon et le dessalage.
2. Permet la séparation des espèces similaires (par exemple, les formes tronquées et oligomères) qui pourraient ne pas être séparées avec d'autres techniques de purification.
3. Est compatible avec de nombreux solvants.
4. Ne dépend pas de n'importe quelle propriété de protéine spécifique pour la rétention et l'élution.

Inconvénients de la SEC:

1. La performance est très sensible à la préparation de la colonne.
2. Peut présenter des interactions non spécifiques entre protéines et résine, ce qui diminue la résolution.
3. Offre une faible résolution pour les mélanges complexes de protéines.
4. L'échantillon doit être chargé dans un petit volume pour une résolution adéquate. Cela peut être problématique pour des protéines qui précipitent à des concentrations élevées.

L’optimisation des conditions de SEC pour atteindre la résolution maximale prend souvent beaucoup de temps, mais certains facteurs peuvent avoir un impact énorme sur la résolution.

Conditions qui augmentent la résolution des protéines en SEC :

1. Réduire au minimum le volume de l'échantillon. Plus le volume est faible, moins diffuses seront les fractions éluées.
2. Ajouter du sel dans le tampon. Une petite quantité de sel aidera à prévenir les interactions non spécifiques entre la protéine et la phase stationnaire. Cela permettra à toutes les protéines de passer au travers de la longueur de la colonne de manière consistante.
3. Utilisation d'un débit modéré. Un débit trop rapide ne donne pas le temps pour les petites molécules de pénétrer dans les pores de la matrice, alors qu’un débit trop lent donne plus de temps pour la diffusion de l'échantillon.
4. Veiller à ce que la viscosité de l‘échantillon et des solvants soient similaires. Ajuster les conditions de l'échantillon pour correspondre approximativement à celle du tampon.
5. Réglez la longueur de la colonne. Une colonne qui est trop courte ne permet pas la séparation adéquate des protéines. Alors qu’une colonne qui est trop longue conduira à la diffusion de l'échantillon de protéine.
6. Remplissage de la colonne. La préparation de la colonne peut avoir un effet énorme sur la résolution des protéines.

Si les particules ne sont pas bien dispersées ou si des bulles d'air sont emprisonnées dans la colonne alors le passage de l’échantillon à travers la phase stationnaire ne se fera pas correctement. De plus, si la colonne est autorisée à fonctionner à sec, elle doit être remplie à nouveau. Un mauvais garnissage de la colonne est souvent à blâmer pour une résolution faible inexplicable.

Parce que SEC ne sépare pas les protéines sur la base d’interactions avec un groupe fonctionnel, toutes les protéines sont éluées dans les mêmes conditions et, par conséquent, la résolution ne peut être obtenue que pour des protéines de rayon hydrodynamique très différent. Par conséquent, SEC n'est pas une méthode chromatographique appropriée pour les étapes initiales d'un système de purification quand il y a beaucoup de protéines contaminantes. Cependant, SEC offre une méthode rapide et fiable pour éliminer les sels ou de petites molécules à partir d'un échantillon entre le début ou les étapes intermédiaires de la purification. Dans les dernières étapes de purification, où seules des traces de contaminants existent, SEC est une méthode utile pour l'isolement des protéines et l'échange dans le tampon de stockage.

Les protéines qui se lient à une phase stationnaire sont éluées par des conditions de solvant qui perturbent les interactions. Ces conditions d'élution varient en fonction du type de la chromatographie et des propriétés de la protéine d'intérêt. Il existe trois méthodes générales d'élution des protéines: élution en une étape, élution par étapes, et un gradient d'élution linéaire. La meilleure méthode à choisir dépend du type de chromatographie utilise et de la résolution requise.

1. Une étape - une seule étape d’élution déplace toutes les protéines liées. Ce mécanisme fonctionne le mieux pour les procédures chromatographiques basées sur une interaction très spécifique (par exemple, la chromatographie d'affinité). L’élution en une étape n'offre pas de résolution, mais est idéale pour se débarrasser des contaminants très rapidement. Elle nécessite la connaissance préalable des conditions de tampon nécessaires pour le déplacement de la protéine d'intérêt.
2. Par étapes - plusieurs élutions sont effectuées séquentiellement, avec des conditions plus strictes à chaque étape. Dans une élution par étape, le nombre de fractions recueillies est fonction du nombre de conditions d'élution séquentielles. L’élution par étapes fournit une meilleure résolution que l’élution en une étape, mais une résolution plus faible que le gradient d'élution linéaire.
3. Gradient linéaire - plusieurs fractions consécutives sont rassemblées tandis que les conditions d'élution sont ajustées de façon linéaire. Un gradient linéaire offre la plus haute résolution pour la chromatographie échangeuse d'ions et la chromatographie d'interaction hydrophobe. En règle générale, un grand nombre de fractions consécutives sont collectées.

La chromatographie d'exclusion de taille ne nécessite aucune de ces méthodes d'élution, comme aucune interaction ne se produit entre la protéine et la phase stationnaire. La protéine est chargée sur la colonne, et un grand nombre de fractions sont recueillies jusqu'à ce que toutes les protéines soient éluées, sans altérer les conditions de tampon durant toute la procédure.

Idéalement, le tampon d'élution d’une colonne est compatible avec la colonne suivante, ce qui élimine la nécessité d'un échange de tampon ou de dialyse entre les étapes de purification.

Après chaque séparation chromatographique, les fractions doivent être analysées pour déterminer les fractions contenant la protéine d'intérêt et la pureté relative de chacune de ces fractions. Cette analyse est nécessaire après chaque étape pour décider quelles fractions doivent être combinées pour une utilisation ultérieure. Pour déterminer la pureté, un test qui peut mesurer la quantité d'une protéine spécifique par rapport à la quantité de protéine totale est requis. Les tests suivants sont couramment utilisés pour l'analyse de pureté:

1. Électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) - un gel dénaturant qui sépare les protéines en fonction de leur taille. Des colorants disponibles dans le commerce permettent une représentation visuelle de toutes les protéines dans l'échantillon, en offrant une évaluation qualitative de la pureté de la protéine (figure 10). L’électrophorèse SDS-PAGE n'est pas idéale pour l'analyse à haut débit des fractions et peut prendre plusieurs heures, mais est le plus souvent utilisée car facile, peu coûteuse et adaptée à n'importe quelle protéine.

   

   Figure 10. Électrophorèse SDS-PAGE d'échantillons collectés au cours d'un procédé de purification des protéines. Le gel est coloré pour la visualisation de toutes les protéines.de http://www.omicsonline.org/.
2. Spectroscopie - un procédé pour analyser les propriétés optiques des protéines. Cette technique d'analyse de la pureté de la protéine est seulement adaptée pour les protéines, telles que les cytochromes P450, qui ont une caractéristique spectroscopique unique. Les protéines de cette famille absorbent la lumière à une longueur d'onde là où d'autres protéines n’absorbent pas (autour de 420 nanomètres [33] ), de sorte que la comparaison de l'absorbance à 420 nm par rapport à 280 nanomètres (la longueur d'onde à laquelle toutes les protéines absorbent), peut fournir une mesure quantitative de pureté de la protéine. Cette méthode est rapide et à haut débit, mais uniquement pour certaines protéines.
3. L'activité de protéine - un test enzymatique qui dépend de la protéine d'intérêt. Cette méthode d'évaluation de la pureté de la protéine est souvent associée à une autre forme de détermination de la concentration en protéines pour calculer l'activité par rapport à la concentration totale en protéines. Les dosages d'activité ne conviennent que pour des protéines ayant une activité qui peut facilement être mesurée dans un format à haut débit, telles que les protéases. Pour certaines protéines, des tests d'activité fournissent une méthode rapide et fiable pour la détection des protéines. La mesure de l'activité est souvent idéale pour les enzymes, parce que la protéine qui a perdu activité peut être exclue de toutes applications ultérieures.

Lorsque les protéines sont considérées comme suffisamment pures pour être utilisées dans des études expérimentales, elles doivent être entreposées de manière appropriée. La sélection d'un tampon de stockage final est tout aussi importante que le choix des tampons utilisés pendant la purification, et doit dépendre de la stabilité de la protéine et des conditions requises pour l'application en aval de la protéine purifiée. Souvent, la chromatographie par exclusion de taille est choisie en tant que dernière étape du procédé de purification, car le tampon de stockage peut être utilisé dans cette étape chromatographique efficace d'échange de tampon. Les fractions pures peuvent être mises en commun pour le stockage immédiat. Alternativement, les fractions finales regroupées peuvent être dialysées dans le tampon sélectionné pour le stockage.

Les conditions de stockage des protéines dépendent de la protéine d'intérêt et doivent être optimisées de sorte que la protéine maintienne sa stabilité structurale et fonctionnelle sur de longues périodes de stockage. Des additifs sont souvent inclus dans le tampon de stockage pour améliorer la durée de vie des protéines purifiées. Plusieurs essais sont souvent nécessaires pour déterminer les conditions optimales, comme toutes les protéines se comportent différemment.

Labome a revu 98 publications citant les méthodes de purification de protéines, avec un total de 242 exemples. La table 10 présente les principaux fournisseurs et les méthodes de purification. Les méthodes d’affinité et d’exclusion de taille sont les approches les plus couramment utilisées dans la littérature. GE Healthcare est le principal fournisseur pour toutes les méthodes, et Qiagen est le fournisseur prédominant pour la purification de protéines taguées avec le tag HIS, et Sigma Aldrich, pour la purification de protéines taguées avec le tag FLAG.

Parmi la littérature revue, les échantillons de protéines étaient préparés à l’aide de EMD Millipore BugBuster [73], [107], [50] ou AVESTIN EmulsiFlex C-3 cell disruptor [55] [124], et ont été concentrés à l’aide de EMD Millipore Amicon Ultra concentrators [120] [96] [110] [125] [81] ou deVivaspin concentrators [73] [122] [77] [120].